تصنيع مقلوب الغروية كريستال بولي (جلايكول الإثيلين) سقالة: وثلاثي الأبعاد منصة الثقافة خلية للهندسة الأنسجة الكبد

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصنيع سقالات بلورية غروانية معكوسة قائمة على الـ PEG مع مصفوفة خارج خلوية مخصصة لتطبيقات هندسة أنسجة الكبد. تُعد هندسة أنسجة الكبد مجالاً واعداً في هندسة الأنسجة والطب التجديدي. نحن نعمل على إنشاء سقالة هندسية ثلاثية الأبعاد تسمح لخلايا الكبد بالحفاظ على وظيفتها لفترة طويلة.

تمتد تطبيقات هذه التقنية إلى اختبار الأدوية، حيث إن خلايا الكبد المستزرعة باستخدام هذا النظام قد تحتفظ بوظائفها لفترة أطول وتظهر استجابة أفضل للدواء. وعلى الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول هندسة الأنسجة، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى، مثل تلك التي تستخدم الخلايا الجذعية. ستقوم هيتومي، وهي طالبة دراسات عليا من مختبري، بتوضيح الإجراء.

لتحضير قوالب الخرزات الدقيقة، ابدأ بقص أطراف أنابيب جهاز الطرد المركزي الدقيقة المقاومة للغليان بسعة 0.2 milliliter عند مستوى 40 µL. استخدم غراءً مقاومًا للماء لصق الجزء العلوي من الأنابيب المقصوصة بشرائح غطاء المجهر الزجاجية، ثم ضع الغراء حول القوالب. بعد ذلك، استبدل الماء في قارورة الكرات الدقيقة من البوليسترين بـ 70% ethanol.

ضع محلول الكرات في حمام موجات فوق صوتية وقم بمعالجة الخليط بالسونيكاتين بقدرة 30 وات لمدة ثلاث دقائق لتفكيك الكرات المتجمعة. بمجرد تحضير الكرات المجهرية، استخدم الماصة لنقل 100 ميكرولتر من الإيثانول إلى كل قالب من القوالب. بعد ذلك، اقطع أربعة مليمترات من طرف رأس ماصة سعة 200 ميكرولتر، واستخدمه لسحب 25 ميكرولتر من الكرات المجهرية من البوليسترين ووضعها في القالب مرتين.

ضع القوالب على هزاز مائل واضبطه على 120 RPM. اترك العينات على الهزاز طوال الليل. وفي اليوم التالي، ضع القوالب تحت المجهر وتحقق من أن الكرات مرتبة بشكل سداسي.

اترك الإيثانول يتبخر في درجة حرارة الغرفة لمدة ليلتين. في هذه المرحلة، ضع مجمع القالب والخرز بعناية في فرن عند درجة حرارة 130 degrees Celsius لمدة ست ساعات لعمل تلدين لخرز البوليسترين وتشكيل القالب السلبي للسقالة ثلاثية الأبعاد. أولاً، قم بتخليق ماكرومرات بولي إيثيلين جليكول دياكريلات باستخدام البروتوكولات المعتمدة كما هو موضح في هذين المرجعين.

بعد ذلك، قم بتحضير محلول بتركيز 50% من PEGDA في ماء منزوع الأيونات، ثم قم بإجراء عملية الطرد المركزي للمزيج حتى يذوب تماماً. بالنسبة للسقالات المقترنة بالمصفوفة خارج الخلوية، أضف 10% إضافية من krill oil PEG NHS إلى محلول PEGDA بتركيز 50%. ثم، قم بتحضير محلول مخزون بتركيز 20% من البادئ الضوئي في إيثانول بتركيز 70%.

أضف 50 µL من محلول البادئ الضوئي لكل 1 mL من خليط PEGDA. بعد ذلك، قم برج الخليط باستخدام جهاز الفورتكس لمدة دقيقة واحدة. تالياً، قم بإزالة القوالب عن الشرائح الزجاجية، وادفع الشبكات للخارج بعناية باستخدام ملعقة مختبر (spatula) وضعها في أنابيب طرد مركزي منفصلة سعة 1.5 mL.

قم بنقل 300 µL من محلول PEGDA إلى كل أنبوب باستخدام الماصة، ثم قم بإجراء عملية الطرد المركزي للأنابيب للسماح لمحلول PEGDA بالتغلغل داخل الشبكة البوليسترينية. بعد ذلك، أخرج الشبكة من الأنبوب باستخدام الملاقط وجفف محلول PEGDA الزائد من على السطح بعناية. ضع الشبكة على زجاج مغطى بفيلم البارافين بحيث يكون السطح الدائري المسطح موجهاً للأعلى.

بعد ذلك، يتم تعريض السقالة لضوء فوق بنفسجي بطول موجي 365 nanometer لمدة خمس دقائق باستخدام مصباح UV بؤري. ضع حوالي عشر شبكات بلورية مبلمرة من PEGDA في قارورة جديدة وأضف 20 milliliters من THF. رج القوارير على هزاز مداري بسرعة 300 RPM لمدة ست ساعات.

أخرج القارورة كل ساعة إلى ساعتين واستبدل المذيب الذي يحتوي على البوليمر بـ THF طازج. بعد عملية الشطف الأخيرة، أضف الماء إلى محلول THF المستخدم للتحقق مما إذا كانت كرات PS قد ذابت تماماً. إذا كان المحلول أبيض اللون، فقم بإجراء عمليات شطف إضافية حتى يصبح المحلول شفافاً.

لتعقيم السقالات، قم بتجهيز أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 50 مل يحتوي على 2 مل من الإيثانول بتركيز 70% لكل سقالة، وضع السقالات في الأنبوب باستخدام ملعقة مسطحة (spatula). اترك السقالات تنقع في الإيثانول لمدة ساعة واحدة. بعد مرور ساعة، قم بسكب الإيثانول بعناية واستبدله بحجم مساوٍ من محلول PBS المعقم.

بعد ذلك، قم بطرد السقالات مركزياً للتخلص من أي فقاعات. تُحفظ السقالات التي تم طردها مركزياً عند درجة حرارة 4 °C، وتُخرج كل ساعة إلى ساعتين لاستبدال المحلول بمحلول PBS طازج. وبعد إجراء عدة عمليات تغيير لمحلول PBS، تُخرج السقالات ليتم طلائها بالكولاجين، وتوضع في أنبوب يحتوي على 1 mL من الكولاجين من النوع الأول لكل سقالة سيتم طلاؤها.

بعد ذلك، قم بطرد الأنبوب مركزياً كما سبق، ثم قم برج السقالات بسرعة 400 RPM على هزاز مداري لمدة 30 دقيقة. احفظ السقالات طوال الليل في درجة حرارة أربع درجات Celsius. قم بزراعة خلايا سرطان الكبد في أطباق زراعة خلايا سعة 100 مليمتر مع 10 مليمتر من وسط الزراعة.

قم بتغيير الوسط كل ثلاثة أيام حتى تصل كثافة الخلايا إلى 75 إلى 80% من سطح المزرعة. عندما تصبح الخلايا جاهزة، ضع السقالات بعناية بحيث يكون السطح المستوي متجهًا للأعلى في طبق يحتوي على 24 بئراً. بعد ذلك، اشطف كل سقالة باستخدام 2 mL من PBS.

قم بشفط محلول PBS وأضف 2 mL من وسط النمو إلى السقالات. بعد 30 دقيقة، قم بإزالة الوسط واترك السقالة لتجف لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، قم بحصد خلايا سرطان الكبد باستخدام طريقة الهضم بالتريبسين.

بعد تجميع الخلايا في قرص، قم بإزالة السائل الطافي وأعد تعليق القرص بحيث يكون هناك مليون خلية لكل 25 µL. باستخدام الماصة، انقل 25 µL من معلق الخلايا ببطء مباشرة فوق كل سِقالة. بعد ذلك، قم بتغطية الطبق وضعه في الحاضنة طوال الليل.

بعد ذلك، انقل السقالات بعناية إلى طبق جديد مكون من 24 بئراً، ثم أضف باستخدام الماصة 2 mL من الوسط الغذائي في كل بئر قبل إعادة الطبق إلى الحاضنة. تظهر هنا صورة للمسقالة مأخوذة بواسطة المجهر الإلكتروني الماسح؛ حيث تتكون من ترتيب سداسي متراص من المسام التي يبلغ متوسط قطرها من 100 إلى 105 microns، والتي تشكل ترابطات مع المسام المجاورة التي يتراوح قطرها غالباً بين 35 و40 microns.

عند استزراع خلايا سرطان الخلايا الكبدية، نمت الخلايا وتكاثرت على السقالات المطلية مسبقاً بالكولاجين من النوع الأول، بينما لم يتزد number خلاياها على السقالات العارية. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت خلايا سرطان الخلايا الكبدية على السقالات المطلية بالكولاجين وظيفة خلوية أكبر بطريقة تعتمد على التركيز. وفي اليوم 14، أفرزت خلايا سرطان الخلايا الكبدية المستزرعة في سقالات ICC المطلية بتركيز 400 microgram per milliliter كمية من الألبومين تزيد بثلاثة أضعاف عن تلك المستزرعة في السقالات العارية.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر التأكد من ترتيب كرات البولي ستيرين في الشبكة بشكل صحيح؛ حيث سيؤدي الترتيب الضعيف إلى ضعف في الترابط البيني، مما قد يؤثر سلباً على نشاط الخلايا. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصنيع سقالات البلورات الغروية المقلوبة القائمة على PEG والمنقبة والمغطاة بطبقة طلاء.

لا تنسَ أن العمل مع رباعي هيدرو الفوران قد يكون خطيراً، ويجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة مثل العمل داخل خزانة استخلاص الأبخرة وارتداء القفازات والنظارات الواقية عند تنفيذ هذا الإجراء.