الإنتاجية العالية جين توصيف في

الهدف العام من هذه الطريقة هو وسم البروتينات في طفيل Trypansoma brucei بطريقة عالية الإنتاجية. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال الكينيتوبلاستيات حول التموضع والوظيفة المحتملة لمجموعات كبيرة من البروتينات. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية وسم أعداد كبيرة من البروتينات بالتوازي وبشكل سريع وسهل.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية حول التموضع الخلوي، إلا أنه يمكن أيضاً استقصاء تفاعلات مجموعات كبيرة من البروتينات باستخدام علامات أخرى. على سبيل المثال، علامة BirA لتجربة رسم خرائط التقارب باستخدام BirA (bio-ID). سيقوم بشرح هذا الإجراء روس مادن، وهو مساعد بحث من مختبرنا.

قبل البدء في هذا الإجراء، قم بتجميد مبرد PCR ذي 96 بئراً مسبقاً في مجمد بدرجة حرارة -80 °C. قم بتحضير المزيج الرئيسي A (Master Mix A) عن طريق دمج المكونات التالية في أنبوب سعة 10 milliliter: 100 microliters من الماء المقطر منزوع الأيونات، و105 microliters من DMSO بدرجة PCR، و105 microliters من dNTPs بتركيز 10 millimolar، و105 microliters من قالب pPOT.

صُب المزيج الرئيسي A (Master Mix A) في خزان الكواشف، ثم وزع 23 µL من المزيج الرئيسي A في كل بئر من آبار لوحة PCR ذات الـ 96 بئرًا. وباستخدام ماصة متعددة القنوات P20 ذات 12 قناة، أضف 2 µL من البادئات المجمعة بتركيز 100 µM إلى كل بئر تم ملؤه. أغلق اللوحة بإحكام باستخدام الغشاء اللاصق.

ضعها في مبرد PCR المبرد مسبقاً واتركها لتتجمد لمدة لا تقل عن 20 دقيقة عند درجة حرارة -80 °C. يعد تجميد PCR Master Mix A أمراً بالغ الأهمية لضمان كفاءة تفاعل البداية الساخنة (hot start reaction)، حتى عند استخدام بوليميراز بداية ساخنة محدد. يؤدي ذلك إلى تضخيم عالي المردود وقابل للتكرار.

بينما يكون لوح PCR في المجمد، قم بتحضير المزيج الرئيسي B. اخلط المكونات التالية في أنبوب سعة 10 milliliter: 2,048 microliters من الماء المقطر منزوع الأيونات، و 525 microliters من منظم pH بتركيز 10X، و 52.5 microliters من إنزيم البوليميراز، ليصبح الحجم الإجمالي 2,626 microliters لكل لوح. أخرج لوح PCR ومبرد PCR من المجمد عند درجة حرارة minus 80 degrees Celsius.

بينما لا تزال اللوحة على مبرد PCR، أضف بسرعة 25 microliters من Master Mix B فوق Master Mix A المجمد في كل بئر، ليصل إجمالي حجم التفاعل إلى 50 microliters. هذه الخطوة حساسة للغاية من حيث الوقت ويجب إتمامها قبل أن يذوب Master Mix A. قم بإغلاق اللوحة باستخدام الفيلم.

اضبط الجهاز الحراري (thermal cycler) كما يلي: 94 °C لمدة 10 دقائق، ثم 30 دورة تتكون من 94 °C لمدة 15 ثانية، و65 °C لمدة 30 ثانية، و72 °C لمدة دقيقتين، تليها فترة تمديد نهائية عند 72 °C لمدة سبع دقائق. بعد وصول الكتلة الحرارية إلى 94 °C، ضع لوحة الـ PCR في الجهاز الحراري وابدأ برنامج التضخيم.

ابدأ هذا الإجراء بتحضير هلام أغاروز بتركيز 1% في محلول منظم Tris-acetate EDTA أو TAE، مع توفير أربعة صفوف من الفتحات. قم بتحميل سلم DNA بحجم 1 kb في الفتحتين الأولى والثامنة والعشرين من كل صف. الخطوة التالية هي نقل 2 µL من ناتج PCR مباشرة، دون استخدام محلول تحميل DNA، إلى كل مسار في الهلام، وفقاً للنمط الموضح هنا.

على سبيل المثال، يتم تحميل نواتج PCR من الصفين A و B من لوحة PCR في المسارات ذات الأرقام الفردية والزوجية في الصف الأول من الهلام، على التوالي. وبسرعة لتقليل احتمالية تلوث مضاعفات الـ DNA، قم بتحميل نواتج PCR من الصف A من لوحة PCR في المسارات ذات الأرقام الفردية في الصف الأول من الهلام. بعد ذلك، قم بتحميل نواتج PCR من الصف B من لوحة PCR في المسارات ذات الأرقام الزوجية في الصف الأول من الهلام.

قم بتحميل نواتج الـ PCR من الصفين C و D من لوحة الـ PCR باتباع النمط ذاته، بحيث يتم وضع الصف C في المسارات ذات الأرقام الفردية والصف D في المسارات ذات الأرقام الزوجية من الصف الثاني للهلام. استمر في نمط التحميل هذا حتى يتم تحميل كل بئر من لوحة الـ PCR على الهلام. ضع الهلام في خزان التشغيل واملأ الخزان بمحلول TAE المنظم الخاص بالتشغيل حتى يغمر الهلام تماماً.

قم بالتشغيل عند 100 فولت لمدة 30 دقيقة. قم بالتصوير باستخدام جهاز عرض الأشعة فوق البنفسجية (UV transilluminator). يظهر هنا هلام أغاروز تمثيلي للتحقق من تفاعل PCR لـ 96 بئراً، حيث نجحت 95 من أصل 96 تفاعلاً من تفاعلات PCR.

كانت عملية الـ PCR غير الناجحة هي H11. يستخدم هذا الإجراء سلالة خلايا SMOXP9 من شكل الـ procyclic لطفيلي Trypansoma brucei. قم بتنمية الخلايا حتى تصل إلى الكثافة المناسبة كما هو موضح في نص البروتوكول، ثم اجمع العدد المطلوب من الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 800 ×g لمدة 10 دقائق.

ابدأ في تجهيز عملية التثقيب الكهربائي أثناء عملية طرد الخلايا مركزياً. قم بتوصيل مناول الأطباق بجهاز التثقيب الكهربائي. وفي وحدة التثقيب الكهربائي، اضبط الجهد على 1,500 فولت، ومدة النبضة على 100 ميكروثانية، وعدد النبضات على 12، والفترة الفاصلة بين النبضات على 500 مللي ثانية.

في جهاز مناولة الأطباق، اضبط عدد النبضات على واحد. وباستخدام ماصة متعددة القنوات P200 ذات 12 قناة، انقل تفاعلات PCR من طبق PCR إلى طبق تخثير كهربائي يستخدم لمرة واحدة مكون من 96 بئراً. اغسل الخلايا في 10 milliliters من cytomix المعدل ثم قم بالطرد المركزي مرة أخرى عند 800 ×g لمدة 10 minutes.

أعد تعليق الخلايا في 23 milliliters من الـ cytomix المعدل للوصول إلى تركيز نهائي قدره 5 × 10⁷ خلية لكل milliliter. انقل معلق الخلايا إلى خزان كواشف. انقل بواسطة الماصة 200 µL من محلول الخلايا إلى كل بئر من آبار لوحة التثقيب الكهربائي (electroporation plate) واخلطها مع ناتج الـ PCR عن طريق الماصة.

استخدم منديلاً لإزالة أي قطرات من أعلى الطبق لتجنب حدوث دوائر قصر. ضع غشاء الإغلاق على الجزء العلوي من طبق التثقيب الكهربائي، مع وضعه بحيث تظل فتحات الأقطاب الكهربائية غير مغطاة في أعلى وأسفل كل عمود. تجنب تغطية النقاط البارزة المستخدمة لتوجيه الغشاء.

ضع لوحة التثقيب الكهربائي في معالج الألواح وأغلق الغطاء. اضغط على زر "pulse" في وحدة التثقيب الكهربائي. بعد عملية التثقيب الكهربائي، يجب نقل الخلايا بسرعة إلى أربعة أطباق زراعة أنسجة مكونة من 24 بئراً، بحيث يحتوي كل بئر على 1 mL من وسط SDM-79 من أجل الاستعادة.

استخدم ماصة متعددة القنوات P200 ذات 12 قناة مع إزالة رأس واحد بالتناوب، بحيث تتماشى الرؤوس الستة المتبقية مع الصفوف الستة في طبق زراعة أنسجة ذي 24 بئرًا. بعد نقل الخلايا من الطبق ذي 96 بئرًا إلى الطبق ذي 24 بئرًا، اغسل الآبار في الطبق ذي 96 بئرًا باستخدام الوسائط من الآبار المقابلة في الطبق ذي 24 بئرًا. بعد ذلك، انقل سائل الغسيل مرة أخرى إلى الآبار في الطبق ذي 24 بئرًا.

انقل الخلايا التي خضعت للتثقيب الكهربائي من لوحة التثقيب الكهربائي ذات الـ 96 بئرًا إلى ألواح زراعة الأنسجة ذات الـ 24 بئرًا وفقًا للنمط المحدد مسبقًا الموضح هنا. على سبيل المثال، تُنقل الخلايا من الآبار ذات الأرقام الفردية في الصف A من اللوحة ذات الـ 96 بئرًا إلى الصف A في اللوحة A، بينما تُنقل الخلايا من الآبار ذات الأرقام الزوجية في الصف A من اللوحة ذات الـ 96 بئرًا إلى الصف A في اللوحة C. بعد كل عملية نقل للخلايا من اللوحة ذات الـ 96 بئرًا إلى اللوحة ذات الـ 24 بئرًا، اغسل الآبار في اللوحة ذات الـ 96 بئرًا باستخدام الوسط المستزرع من الصف المقابل في اللوحة ذات الـ 24 بئرًا. ثم، انقل سائل الغسيل مرة أخرى إلى اللوحة ذات الـ 24 بئرًا.

قد تكون عملية نقل الخلايا إلى أطباق ذات 24 بئرًا مربكة، ولكن يجب أن تكون قادرًا على تتبع الخطوط الخلوية الناتجة وربطها بمعرف الجين الصحيح. ومن الضروري تنفيذ هذه الخطوة بسرعة للحفاظ على سلامة الخلايا. وبعد نقل جميع الخلايا التي خضعت للتثقيب الكهربائي إلى الأطباق الأربعة ذات 24 بئرًا، ضع هذه الأطباق في صندوق بلاستيكي نظيف مزود بغطاء يغلق بإحكام، ثم ضع الصندوق في حاضنة عند درجة حرارة 28 degree Celsius.

بعد مرور ست إلى ثماني ساعات، أضف إلى كل بئر 1 mL من وسط SDM-79 مع 10% FCS يحتوي على مضاد حيوي انتقائي. يتم التحضين عند 28 °C لمدة تتراوح من 9 إلى 10 أيام حتى تصبح الخطوط الخلوية المعدلة وراثياً مرئية. بعد عملية عفن (transfection) في طبق 96 بئراً لوسم 96 بروتيناً مختلفاً عند الطرف النهائي، تُنقل الخلايا إلى أطباق زراعة أنسجة ذات 24 بئراً لغرض التعافي والانتخاب.

يتم بعد ذلك تقييم كل بئر لتحديد ما إذا كان يحتوي على خلايا سليمة ومقاومة للعقاقير. يحتوي البئر السليم بشكل أساسي على خلايا عالية النشاط تظهر ساطعة تحت مجهر تباين الطور. في هذا المخطط التوضيحي، يمثل اللون الأخضر بئراً نجحت فيه عملية عفن الانتقال (transfection)، بينما يمثل اللون الرمادي بئراً يحتوي على خلايا ميتة فقط.

تحتوي 88 من أصل 96 بئر، أي بنسبة 92% من الآبار، على طفيليات تم نقل الجينات إليها بنجاح بعد 15 يوماً من الانتقاء. وبمجرد إتقان هذه العملية، ستستغرق حوالي ساعة واحدة من مرحلة عد الخلايا حتى مرحلة زراعتها في الأطباق بعد عملية التثقيب الكهربائي. وأثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر إضافة الأدوية الانتقائية بعد مرور ست إلى ثماني ساعات من عملية نقل الجينات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية وسم مجموعات كبيرة من البروتينات في Trypanosoma brucei.