الإنتاجية العالية جين توصيف في المثقبية البروسية

الهدف العام من هذه الطريقة هو وضع علامات على البروتينات في المثقبية البروسية بطريقة عالية الإنتاجية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال حمض الحركية حول التوطين والوظيفة المحتملة لمجموعات كبيرة من البروتينات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تمييز أعداد كبيرة من البروتينات بسرعة وسهولة بالتوازي.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للتوطين ، إلا أنه يمكن أيضا التحقيق في تفاعلات مجموعات كبيرة من البروتينات باستخدام علامات أخرى. على سبيل المثال، علامة BirA لتجربة رسم خرائط القرب للمعرف الحيوي. سيوضح الإجراء روس مادن ، مساعد باحث من مختبرنا.

قبل البدء في هذا الإجراء ، قم بتجميد مبرد PCR سعة 96 بئرا مسبقا في الفريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر. قم بإعداد Master Mix A عن طريق الجمع بين ما يلي في أنبوب سعة 10 مل. 2 ، 100 ميكرولتر من الماء المقطر منزوع الأيونات ، 105 ميكرولتر من DMSO من فئة PCR ، 105 ميكرولتر من 10 ملليمولار dNTPs ، و 105 ميكرولتر من قالب pPOT.

صب Master Mix A في خزان كاشف وتناول 23 ميكرولترا من Master Mix A في كل بئر من لوحة PCR سعة 96 بئرا. باستخدام ماصة P20 متعددة القنوات ذات 12 قناة، أضف ميكرولترين من 100 ميكرومولار أولي مجمع لكل بئر محمل. ختم اللوحة بالفيلم.

ضعه على مبرد PCR المبرد مسبقا واتركه يتجمد لمدة 20 دقيقة على الأقل عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. يعد تجميد PCR Master Mix A أمرا بالغ الأهمية لضمان تفاعل فعال للبدء على الساخن ، حتى عند استخدام بوليميراز محدد للبدء على الساخن. هذا يؤدي إلى تضخيم قابل للتكرار وعالي الغلة.

أثناء وجود لوحة PCR في الفريزر ، قم بإعداد Master Mix B.امزج ما يلي في أنبوب سعة 10 مل. 2 ، 048 ميكرولتر من الماء المقطر منزوع الأيونات ، و 525 ميكرولتر من 10X عازلة ، و 52.5 ميكرولتر من البوليميراز ، بحجم إجمالي يبلغ 2،626 ميكرولتر لكل لوحة. قم بإزالة لوحة PCR ومبرد PCR من الفريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر.

مع بقاء اللوحة على مبرد PCR ، أضف بسرعة 25 ميكرولترا من Master Mix B فوق Master Mix A المجمد في كل بئر للحصول على حجم تفاعل إجمالي يبلغ 50 ميكرولترا. هذا أمر بالغ الأهمية للوقت ويجب إكماله قبل أن يتمكن Master Mix A من الذوبان. ختم اللوحة بالفيلم.

اضبط الدراجة الحرارية على النحو التالي. 94 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، ثم 30 دورة من 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، و 65 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، تليها فترة تمديد نهائية قدرها 72 درجة مئوية لمدة سبع دقائق. بعد أن تصل درجة حرارة الكتلة إلى 94 درجة مئوية ، قم بتحميل لوحة PCR في جهاز التدوير الحراري وابدأ برنامج التضخيم.

ابدأ هذا الإجراء عن طريق تحضير جل agarose كبير بنسبة 1٪ في عازلة تشغيل Tris-acetate EDTA أو TAE ، مع أربعة صفوف من الآبار. قم بتحميل سلم الحمض النووي بحجم كيلو بايت واحد في الآئرين الأول و 28 من كل صف. تتمثل الخطوة التالية في نقل ميكرولترين من منتج PCR مباشرة ، بدون مخزن مؤقت لتحميل الحمض النووي ، إلى كل حارة من الجل ، باتباع النمط الموضح هنا.

على سبيل المثال ، يتم تحميل منتجات PCR من الصفين A و B من لوحة PCR في الممرات ذات الأرقام الفردية والزوجية للصف الأول من الهلام ، على التوالي. العمل بسرعة لتقليل احتمالية تلويث مكبرات الصوت ، قم بتحميل منتجات PCR من الصف A من لوحة PCR في الممرات ذات الأرقام الفردية للصف الأول من الجل. بعد ذلك ، قم بتحميل منتجات PCR من الصف B من لوحة PCR في الممرات ذات الأرقام الزوجية للصف الأول من الجل.

قم بتحميل منتجات PCR من الصفين C و D من لوحة PCR باستخدام نفس النمط ، مع الصف C في الممرات ذات الأرقام الفردية والصف D في الممرات ذات الأرقام الزوجية للصف الثاني من الهلام. استمر في نمط التحميل هذا حتى يتم تحميل كل بئر من لوحة PCR على الجل. ضع الجل في خزان التشغيل واملأ الخزان بمخزن مؤقت TAE حتى يتم غمر الجل.

تشغيل عند 100 فولت لمدة 30 دقيقة. تصور باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية. يظهر هنا جل الاغاروز التمثيلي للتحقق من 96 بئرا من PCR ، حيث نجحت 95 من أصل 96 PCR.

كان تفاعل البوليميراز المتسلسل غير الناجح هو H11. يستخدم هذا الإجراء المثقبية البروسي، الشكل الدائري، خط الخلية SMOXP9. قم بتنمية الخلايا إلى الكثافة المناسبة كما هو موضح في نص البروتوكول وحصاد العدد المطلوب من الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 800 مرة G لمدة 10 دقائق.

ابدأ في الإعداد للتثقيب الكهربائي أثناء الطرد المركزي للخلايا. قم بتوصيل معالج اللوحة بجهاز الثقب الكهربائي. في وحدة المثقور الكهربائي ، اضبط الجهد على 1 ، 500 فولت ، وطول النبضة على 100 ميكروثانية ، وعدد النبضات على 12 ، والفاصل الزمني للنبضة على 500 مللي ثانية.

على معالج اللوحة ، اضبط عدد النبضات على واحد. باستخدام ماصة P200 متعددة القنوات ذات 12 قناة، انقل تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) من لوحة PCR إلى لوحة التثقيب الكهربائي التي يمكن التخلص منها 96 بئرا. اغسل الخلايا في 10 مل من الخلوات المعدلة وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى عند 800 مرة G لمدة 10 دقائق.

أعد تعليق الخلايا في 23 مل من الخلوي المعدل للحصول على تركيز نهائي خمسة في 10 إلى الخلايا السابعة لكل مليلتر. انقل تعليق الخلية إلى خزان الكاشف. ماصة 200 ميكرولتر من محلول الخلية في كل بئر من لوحة التثقيب الكهربائي وتخلط مع منتج PCR عن طريق سحب العينات.

استخدم منديلا لإزالة أي قطرات من أعلى اللوحة لتجنب حدوث ماس كهربائي. ضع طبقة مانعة للتسرب على الجزء العلوي من لوحة التثقيب الكهربائي ، ووضعه بحيث يترك فتحات الأقطاب الكهربائية مكشوفة في أعلى وأسفل كل عمود. تجنب تغطية النقاط البارزة المستخدمة لتوجيه الفيلم.

قم بتحميل لوحة التثقيب الكهربائي في معالج اللوحة وأغلق الغطاء. اضغط على النبض "على وحدة المثقور الكهربائي. بعد التثقيب الكهربائي ، يجب نقل الخلايا بسرعة إلى أربع ألواح لزراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا تحتوي على ملليلتر واحد من وسائط SDM-79 لكل بئر للتعافي.

استخدم ماصة P200 متعددة القنوات ذات 12 قناة مع فقدان كل طرف آخر، بحيث تصطف الأطراف الستة المتبقية مع الصفوف الستة على لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا. بعد نقل الخلايا من الصفيحة المكونة من 96 بئرا إلى الصفيحة المكونة من 24 بئرا ، اغسل الآبار في اللوحة المكونة من 96 بئرا بوسائط من الآبار المقابلة في اللوحة المكونة من 24 بئرا. ثم انقل الغسيل مرة أخرى إلى الآبار الموجودة في الطبق المكون من 24 بئرا.

انقل الخلايا الكهربائية من لوحة التثقيب الكهربائي المكونة من 96 بئرا إلى ألواح زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا في النمط المحدد مسبقا الموضح هنا. على سبيل المثال ، يتم نقل الخلايا من الآبار ذات الأرقام الفردية للصف A من الصفيحة المكونة من 96 بئرا إلى الصف A من اللوحة A ، بينما يتم نقل الخلايا من الآبار ذات الأرقام الزوجية للصف A من الصفيحة المكونة من 96 بئرا إلى الصف A من اللوحة C. بعد كل نقل للخلايا من اللوحة المكونة من 96 بئرا إلى اللوحة المكونة من 24 بئرا ، اغسل الآبار في اللوحة المكونة من 96 بئرا بوسط من الصف المقابل للوحة 24 بئرا. ثم انقل الغسيل مرة أخرى إلى الطبق المكون من 24 بئرا.

يعد نقل الخلايا إلى الألواح المكونة من 24 بئرا أمرا محيرا ، ولكن يجب أن تكون قادرا على تتبع خطوط الخلايا الناتجة إلى الجين الصحيح ID.It أمر بالغ الأهمية للقيام بهذه الخطوة بسرعة للحفاظ على صحة الخلايا. بعد نقل جميع الخلايا الكهربائية إلى الألواح الأربعة المكونة من 24 بئرا ، ضع الألواح المكونة من 24 بئرا في صندوق بلاستيكي نظيف بغطاء يشكل ختما محكما. ضع الصندوق في حاضنة 28 درجة مئوية.

بعد ما بين ست إلى ثماني ساعات ، أضف إلى كل بئر مليلتر واحد من SDM-79 مع 10٪ FCS يحتوي على مضاد حيوي انتقائي. احتضن عند 28 درجة مئوية لمدة تسعة إلى 10 أيام حتى تصبح خطوط الخلايا المعدلة وراثيا مرئية. بعد تعداء 96 بئرا لوضع علامات على 96 بروتينا مختلفا في الطرف النهائي ، يتم نقل الخلايا إلى ألواح زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا للتعافي والاختيار.

ثم يتم تقييم كل بئر لتحديد ما إذا كان يحتوي على خلايا صحية مقاومة للأدوية. يحتوي البئر الصحي في الغالب على خلايا عالية النشاط ومشرقة في الفحص المجهري المتباين للطور. في هذا المثال التخطيطي ، يمثل اللون الأخضر بئرا مع تعداء ناجح ، ويمثل اللون الرمادي بئرا به خلايا ميتة فقط.

88 من أصل 96 ، أو 92٪ من الآبار ، تحتوي على طفيليات تم نقلها بنجاح بعد 15 يوما من الاختيار. بمجرد إتقانها ، سيستغرق الأمر حوالي ساعة من عد الخلايا إلى طلاءها بعد التثقيب الكهربائي. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إضافة الأدوية الانتقائية بعد ست إلى ثماني ساعات من التعدي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية وضع علامة على مجموعات كبيرة من البروتينات في Trypansoma brucei.