شارك في ثقافة المعيشة Microbiome مع المعوية الزوائد Microengineered الإنسان في الوتر على واحد في رقاقة ميكروفلويديك الأجهزة

الهدف العام من هذا البروتوكول هو إثبات نمو الزغابات للخلايا المعوية البشرية تحت تأثير حركات مشابهة للحركة الدودية والتدفق في جهاز ميكروفلويديك "الأمعاء على شريحة" (gut-on-a-chip)، بالإضافة إلى توضيح كيفية زراعة هذه الخلايا بالاشتراك مع ميكروبيوم الأمعاء الحي. لذا يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات أمراض الجهاز الهضمي، والميكروبيولوجيا السريرية، والعلوم الصيدلانية لتحديد ميكانيكية المرض والتحقق من فعالية وسمية المركبات الدوائية الجديدة. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في قدرة الباحثين على إنشاء نظام بيئي حي ووظيفي لما بعد الميكروبيوم في الأمعاء البشرية الحية مخبرياً باستخدام نظام فسيولوجي ميكروي.

يمكن أن تمتد آثار هذه التقنية لتشمل أمراضاً مثل التهاب القولون التقرحي أو مرض كرون، حيث يمكن للزراعة المشتركة المستقرة لخلايا المضيف مع الميكروبيوم محاكاة تعقيدات هذه الأمراض. وبالرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية واضحة للتفاعلات المعقدة بين ميكروبيوم الأمعاء والجهاز المناعي في المعي، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أعضاء أخرى توجد بها تفاعلات بين المضيف والميكروبات، مثل الجلد، أو الجهاز التناسلي، أو تجويف الفم. للبدء، قم بتحضير جهاز الموائع الدقيقة "الأمعاء على شريحة" (gut-on-a-chip) كما هو موضح في البروتوكول النصي المرفق.

يتكون الجهاز من بوليمر سيليكون شفاف نفاذ للغاز يحتوي على قناتين مجهريتين متوازيتين، يفصل بينهما غشاء مسامي مرن من الـ PDMS. وتوجد غرف تفريغ على كل جانب من القنوات، يمكن استخدامها لتطبيق إجهاد ميكانيكي دوري. قم بتعقيم الجهاز باستخدام حقنة سعة 1 مل لتدفق ethanol بتركيز 70% عبر القنوات.

بعد ذلك، جفف الجهاز في فرن تجفيف عند درجة حرارة 60 degree Celsius طوال الليل. وفي اليوم التالي، قم بتعريض نظام "الأمعاء على شريحة" (gut-on-a-chip) الدقيق، مع الأنابيب المتصلة به، للأشعة فوق البنفسجية والأوزون في آن واحد لمدة 40 دقيقة. اترك الجهاز ليبرد لمدة 15 دقيقة مع بقائه تحت الأشعة فوق البنفسجية داخل كابينة السلامة البيولوجية.

بعد ذلك، قم بتحميل 100 µL من محلول ترميز المصفوفة خارج الخلوية في سرنجة سعة 1 mL، ثم قم بتوزيعها في القناة الدقيقة العلوية للجهاز. كرر هذه العملية لطلاء القناة الدقيقة السفلية أيضاً. ضع المجموعة كاملة في حضانة رطبة عند 37 °C وبتركيز 5% CO2 لمدة ساعة واحدة.

أثناء فترة التحضين، قم بإزالة الغازات من وسط استنبات كامل مُسخن مسبقاً عن طريق تمريره عبر مرشح بمسامية 0.45 ميكرون في نظام ترشيح سعة 50 ملليلتر لمدة دقيقة واحدة. انقر برفق على الوسط المُرشح لمدة دقيقة واحدة لإزالة أي فقاعات أو غازات ذائبة في الوسط. بعد ذلك، انقل الوسط الكامل الخالي من الغازات إلى محقنتين تستخدمان لمرة واحدة بسعة 3 ملليلتر، ثم قم بتحضين المحقنتين لمدة ساعة واحدة.

بعد ذلك، قم بتوصيل المحاقن بالقنوات الدقيقة العلوية والسفلية لشريحة الأمعاء على شريحة (gut-on-a-chip)، واغسل محلول الترميز عن طريق تدفق الوسط الكامل في القنوات الدقيقة العلوية والسفلية بنبضات خفيفة. ثم، استخدم مضخة محاقن لتدفق وسط زراعة الخلايا الكامل منزوع الغازات في القناة الدقيقة العلوية للجهاز، مع تحضين الشريحة طوال الليل عند 37 °C و5% CO2. قم بحصاد قارورة T75 ذات تلاقي كامل تحتوي على خلايا Caco-2 الظهارية المعوية عن طريق شطف الخلايا أولاً بـ 10 mL من PBS خالٍ من الكالسيوم والمغنيسيوم.

بعد ذلك، قم بسحب محلول PBS وكرر عملية الشطف مرتين إضافيتين. ثم أضف 1مل من محلول 0.05%Trypsin-EDTA واحضن القارورة لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. وبمجرد انفصال الخلايا، أضف 10مل من وسط زراعة الخلايا الكامل المُدفأ مسبقًا، وقم بسحب معلق الخلايا وطرده بالماصة من ثلاث إلى خمس مرات قبل نقله إلى أنبوب طرد مركزي.

قم بطرد معلق الخلايا مركزياً. بعد ذلك، قم بإزالة السائل الطافي، وأعد تعليق الخلايا بكثافة 150,000 cells per centimeters squared في وسط كامل مُدفأ مسبقاً. اسحب 500 µL من معلق الخلايا في حقنة تستخدم لمرة واحدة سعة 1 mL، مجهزة بإبرة مقاس 25-gauge وطول 5/8-inch.

بعد ذلك، قم بتوزيع 100 µL من معلق الخلايا في القناة الميكروية العلوية من خلال أنبوب المخرج. ثم، أغلق جميع المداخل والمخارج المتصلة بالقناتين الميكرويتين العلوية والسفلية باستخدام مشابك التثبيت. قم بتحضين المجموعة كاملة لمدة ساعة واحدة للسماح للخلايا الظهارية المعوية بالالتصاق بسطح الغشاء المسامي.

بعد ذلك، قم بإزالة المشابك وتوصيل أنبوب القناة العلوية بمحقنة مملوءة بالوسط الزراعي وموضوعة على مضخة محاقن. استأنف تدفق الوسط الزراعي إلى القناة الدقيقة العلوية بمعدل 30 µL/h حتى تشكل الخلايا طبقة أحادية متماسكة. وبمجرد أن تشكل الخلايا طبقة أحادية، قم بتوصيل القناة السفلية بالمحقنة الثانية وقم بتروية الوسط الزراعي في كل من اللمعة العلوية والقنوات الدقيقة الشعيرية السفلية بنفس معدل التدفق وهو 30 µL/h.

لإنشاء حركة شبيهة بالتقلصات الدودية في الشريحة، قم أولاً بتشغيل مضخة التفريغ. وصّل غرف التفريغ في الجهاز بوحدة التحكم في التفريغ عبر أنابيب ذات موصل من الفولاذ المقاوم للصدأ. بعد ذلك، اضبط وحدة التحكم بحيث توفر حركة تمدد جيبية دورية تعادل 10% من متوسط انفعال الخلية بتردد 0.15 Hertz، ثم انقر على بدء.

استمر في تدفق وسط استنبات الخلايا إلى كل من القنوات الدقيقة العلوية والسفلية في ظل وجود تشوهات ميكانيكية لمدة 80 ساعة على الأقل لتحفيز نمو الزغابات. قم بتحضير خليط بنسبة 50/50 من مرق Autoclaved Lactobacilli MRS Broth ووسط Reinforced Clostridial Medium. بعد ذلك، أعد تعليق خليط بكتيري بروبيوتيك مجفف بالتجميد في 10 milliliters من هذا الخليط.

قِس الكثافة الضوئية للمزيج عند 600 نانومتر واضبط الكثافة الخلوية النهائية لتكون حوالي 0.2 وحدة كثافة ضوئية. وزع ثلاثة ملليلترات من معلق الخلايا الميكروبية المعدل في أنابيب معقمة مخصصة للاستخدام مرة واحدة سعة 10 ملليلتر. ضع العينات الموزعة في وعاء لاهوائي وأضف ظرفين من أكياس توليد الغاز اللاهوائية إلى الوعاء.

أغلق غطاء الحاوية بإحكام واترك مجموعة الحاوية في الحاضنة طوال الليل دون هز. بعد ذلك، قم بتحضير وسط زراعة خلايا خالٍ من المضادات الحيوية ومنزوع الغازات، ثم قم بتعبئته في محاقن بلاستيكية تستخدم لمرة واحدة سعة ثلاثة مليلتر. انقل جهاز "الأمعاء على شريحة" (gut-on-a-chip) الذي يحتوي على خملات مصممة هندسياً دقيقاً إلى كابينة السلامة البيولوجية.

قم بإزالة المحاقن المتصلة بالقنوات الدقيقة العلوية والسفلية للجهاز واستبدلها بمحاقن تحتوي على وسط زراعة خلوي خالٍ من المضادات الحيوية ومنزوع الغازات. وبمجرد الانتهاء، أعد الجهاز إلى حاضنة CO2. بعد ذلك، قم بتدفق وسط الزراعة الخالي من المضادات الحيوية داخل الجهاز لمدة 12 ساعة قبل تثبيت الميكروبيوم.

بعد ذلك، قم بطرد خليط الخلايا البكتيرية البروبيوتيك المستزرعة مسبقاً بواسطة جهاز الطرد المركزي. اسحب السائل الطافي، ثم أعد تعليق البكتيريا في وسط DMEM الخالي من المضادات الحيوية. قم بتحميل 100 µL تقريباً من معلق الخلايا هذا في حقنة سعة 1 mL متصلة بإبرة مقاس 25-gauge وطول 5/8-inch.

قم بحقن البكتيريا في الجانب اللمعي للقناة الدقيقة التي تحتوي على الزغابات المعوية التي كانت خالية من الجراثيم سابقاً. اترك الخلايا الميكروبية تلتصق بالسطح القمي للزغابات المعوية لمدة ساعة ونصف بدون تدفق عن طريق غلق الأنابيب. بعد ذلك، قم بترويح وسط زراعة خالٍ من المضادات الحيوية ومسخن مسبقاً في كل من القناتين الدقيقتين العلوية والسفلية بمعدل 40 µL في الساعة مع تشويهات إيقاعية دورية.

يتيح بروتوكول الزراعة المشتركة هذا الاستعمار المستقر لأنواع متعددة من البكتيريا الحيوية (probiotic) في الحيز بين الزغابات. ويمكن الحفاظ على مستعمرات بكتيرية دقيقة قابلة للحياة لمدة تصل إلى أسبوعين في الزراعة المشتركة. يظهر هنا نموذج مختلف للزراعة المشتركة يتكون من بكتيريا E.coli الموسومة بـ GFP وزغابات معوية.

يُظهر التكبير عالي القوة بوضوح موقع المستعمرات البكتيرية الدقيقة عند النقطة الزمنية 72 ساعة. وأثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر حقن الوسط الزرعي ببطء ورفق داخل القنوات الموائعية الدقيقة لتجنب إتلاف الطبقة أحادية الخلايا الظهارية في المراحل المبكرة من الزرع. وبناءً على هذه الطريقة، يمكن أن يوفر منهج الزرع المشترك مع الخلايا المناعية البشرية بعض المؤشرات حول كيفية تواصل الميكروبيوم مع الجهاز المناعي وتأثيراته على التوازن الأمثل لصحة الأمعاء.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعادة تشكيل البيئة الدقيقة للأمعاء البشرية وإثبات إمكانية الزراعة المشتركة بين الميكروبيوم والخملات المعوية البشرية في المختبر. إن العمل مع البكتيريا الممرضة والخلايا البشرية ينطوي على خطورة بالغة، لذا لا تنسَ العمل داخل كابينة السلامة البيولوجية.