بروتوكول لعزل الدائرة ماوس ويليس

الهدف العام من إجراء التشريح هذا هو عزل دائرة الفئران في ويليس لتسهيل دراسة الأوعية الدموية الدماغية للفأر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في دراسة التعبير الجيني الوعائي الدماغي في الأمراض المختلفة التي تؤثر على الأوعية الدماغية مثل مرض الزهايمر والاعتلال الوعائي الدماغي الأميلويدي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن عزل الأوعية الكبيرة بسرعة وسهولة دون تغيير هيكل السفينة.

ابدأ باستخدام مقص القزحية لعمل شق بطول أربعة سنتيمترات في جدار البطن والصفاق لفأر مخدر قاتل أسفل القفص الصدري مباشرة. بعد ذلك ، قم بعمل شق بطول بضعة ملليمترات في الحجاب الحاجز ، واستمر في الشق على طول القفص الصدري بالكامل لفضح التجويف الجنبي. ارفع القص وقم بتثبيت الحافة باستخدام مرقئ ، مع إراحة المرقئ على الرقبة.

ثم قم بقص الأنسجة الدهنية التي تربط القص بالقلب بعناية. الآن مرر إبرة وفرة عيار 15 عبر البطين الأيسر إلى قمة القلب ، واستخدم المقص لقطع أحد فصوص الكبد لإنشاء منفذ للانحياز. قم بتدمير ب 25 إلى 50 مل من PBS بمعدل ضخ 2.5 مل في الدقيقة لمدة عشر دقائق تقريبا.

يجب أن يبيض الكبد حيث يتم استبدال الدم ب PBS. عندما يصبح السائل من الكبد صافيا تماما ، أوقف التروية. لعزل الدماغ ، استخدم مقص القزحية لعمل شق خط الوسط على طول الجلد من الرقبة إلى الأنف.

قم بقص الجلد بمقص القزحية لكشف الجمجمة وإزالة أي عضلات متبقية وأنسجة دهنية. بعد ذلك ، ضع أطراف مقص القزحية في جانب واحد من الثقبة الماغنوم وحرك الأطراف بحذر على طول السطح الداخلي للجمجمة إلى الصماخ السمعي الخارجي. قم بعمل شق مماثل على الجانب الآخر من الثقبة العظمية ، متبوعا بقطع خط الوسط على طول السطح الداخلي للعظم بين الجدارية إلى بداية الخيط السهمي.

ازرع مقص القزحية المغلق في العظم الأمامي بين العينين في الخيط السهمي ، وافتح الشفرات لتقسيم الجمجمة إلى قسمين. باستخدام الملقط ، أمسك البصيلات الشمية واستخدم مقص القزحية لقطع الوصلات العصبية على السطح البطني للدماغ. ثم اغمر الدماغ في طبق بتري 60 ملم من PBS المثلج.

لعزل دائرة ويليس ، انقل الطبق إلى كيس ثلج تحت مجهر تشريح وقم بتحويل الدماغ إلى سطحه الظهري لتصور دائرة ويليس. استخدم الملقط الصغير لإمساك الشرايين الدماغية الأمامية في قاعدة الفصوص الشمية ، وممارسة الضغط لفصل الشرايين عن سلسلة الأوعية الدموية. قطع الشرايين الدماغية الوسطى بنفس الطريقة.

ثم استخدم الأطراف الحادة للملقط لإمساك الشرايين الدماغية الوسطى ورفع بداية الشرايين المتصلة الخلفية ، وفصل كلتا المجموعتين من الشرايين عن الدماغ. بعد ذلك ، ارفع الشرايين الأمامية ، واسحبها برفق فوق الخشاب البصري في الاتجاه الظهري الأمامي. إزالة الشرايين المخيخية العلوية والخلفية بنفس الطريقة ، متبوعا بإزاحة الشريان القاعدي.

أخيرا ، استخدم الملقط لنقل دائرة ويليس بأكملها برفق إلى طبق بتري بطول 60 ملم يحتوي على PBS مثلج ، وقم بتثبيت الأوعية في مكانها باستخدام دبابيس صغيرة ، باستخدام ملقطين لإزالة أي أنسجة دماغية متبقية بعناية. يجب أن تخرج دائرة ويليس في قطعة واحدة ، ويجب أن تكون شفافة قليلا بسبب عدم وجود دم متبقي في الأوعية الدموية. يجب أن تعبر الدائرة النظيفة ل Willis على وجه التحديد عن علامات خلايا العضلات الملساء الوعائية ، مثل Smooth Muscle Actin و Smooth Muscle Heavy Chain و Smoothelin.

النقيض من ذلك ، يجب أن تكون العلامات العصبية ، مثل البروتين السكري قليل التغصن المايلين ، أو البروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة 2 ، بالكاد يمكن اكتشافها في دائرة ويليس. علاوة على ذلك ، فإن التعبير عن العلامة البطانية ، E-Selectin ، في غير دائرة من الأنسجة العصبية ويليس ، يشبه إلى حد بعيد ذلك الذي تم الحصول عليه لدائرة عينات ويليس ، مما قد يعكس وجود شبكة دماغية شعرية. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون ساعتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن الأوعية الدماغية للفأر دقيقة جدا وتنكسر بسهولة. وبالتالي ، يجب إجراء التشريح بعناية فائقة ، دون التسرع ، لضمان حصاد الهيكل بأكمله في قطعة واحدة. بعد تطويرها ، تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الأمراض العصبية الالتهابية لاستكشاف اضطراب الأوعية الدموية الدماغية في نموذج الفأر لمرض الزهايمر والأمراض ذات الصلة مثل اعتلال الأوعية الدماغية النشوانية

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل دائرة ويليس عن الماوس.