مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) وجين تحليل التعبير عن فوس، معربا عن الخلايا العصبية من الطازجة والمجمدة الأنسجة دماغ الفئران

الهدف العام من هذا الإجراء هو فصل الخلايا العصبية التي تعبر عن الحفراء عن أنسجة دماغ الفئران البالغة الطازجة أو المجمدة لفرز الخلايا المنشطة اللاحقة بالفلورة ، أو FACS. يمكن استخدام هذه الطريقة لعزل الخلايا العصبية ذات الأهمية لتحديد التكيف العصبي الجزيئي الفريد للخلايا العصبية السلوكية المنشطة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح باستخدام الأنسجة المجمدة ، مما يسهل عزل الخلايا من مناطق متعددة في الدماغ في أيام مختلفة.

لمعالجة أنسجة المخ الطازجة هذه ، أدخل شفرات حلاقة أو أكثر من شفرات الحلاقة المبردة مسبقا في فتحات مصفوفة تقطيع الدماغ المثلجة لقطع شريحة إكليلية من ملم إلى ملليمترين تحتوي على مناطق الدماغ ذات الأهمية ، ووضع الأقسام على صفيحة زجاجية مبردة أثناء قطعها. أولا ، قم بتشريح منطقة الدماغ التي تهمك ، وتجاهل المناطق الأخرى ، وإزالة المادة البيضاء. لتجميد الأنسجة ، انقل العينات إلى أنبوب دقيق ، واغمر الأنبوب في سالب 40 درجة مئوية إيزوبنتان لمدة 20 ثانية لتخزينها عند سالب 80 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.

لفرم الأنسجة ، اترك العينات تذوب على لوح زجاجي بارد لمدة لا تزيد عن دقيقة واحدة قبل تغطية العينات في قطرة إلى قطرتين من محلول Buffer A. بعد ذلك ، أمسك شفرة حلاقة عمودية تماما على اللوحة ، قم بفرم الأنسجة 100 مرة في كل اتجاه متعامد. لفرم الأنسجة جيدا ، من الأهمية بمكان الحفاظ على الأنسجة رطبة باستخدام Buffer A واتباع أوقات الفرم والاتجاه المحددين.

من الأهمية بمكان إزالة غالبية المادة البيضاء أثناء تشريح الأنسجة والحفاظ على الأنسجة مغطاة بالعازلة A لتحسين كفاءة الفرم والحفاظ على صحة الخلايا. عندما تتم معالجة الأنسجة بدقة ، استخدم شفرة الحلاقة لنقل القطع إلى أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على مليلتر واحد من العازلة الباردة A ، وقم بقلب الأنبوب ثلاث إلى خمس مرات لغمر كل الأنسجة المفرومة في المحلول. لفصل شظايا الأنسجة إلى معلق أحادي الخلية ، قم بتكسير العينات عن طريق الطرد المركزي.

تخلص من المادة الطافية. ثم أضف ببطء ملليلترا واحدا من محلول الإنزيم البارد المذاب حديثا أسفل الجدار الداخلي للأنبوب الصغير. واستخدم ماصة بقطر طرف كبير لشفط كل حبيبات على الفور وتوزيعها بالكامل أربع مرات لتفريق قطع الأنسجة المفرومة.

بعد ذلك ، قم بقلب الأنبوب الدقيق بسرعة لمنع الكريات من الالتصاق بقيعان الأنبوب ، واحتضان العينة بالخلط النهائي لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. في نهاية عملية الهضم ، قم بالطرد المركزي للأنبوب مرة أخرى ، وأضف 0.6 مل من العازلة الباردة A إلى الخلايا. باستخدام نفس طرف الماصة ، قم بشفط الكريات على الفور وتوزيعها خمس مرات.

بعد ذلك، حدد ماصة زجاجية مقاس 1.3 ملم، واستخدمها لترتيتر العينات برفق 10 مرات. ضع العينة على الجليد لمدة دقيقتين للسماح للحطام والخلايا غير المنفصلة بالاستقرار في قاع الأنبوب. ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 15 ملليلترا.

بعد ذلك ، أضف 600 ميكرولتر من محلول Buffer A إلى الحبيبات المتبقية ، واستخدم ماصة قطرها 0.8 ملم لترتيبات العينة 10 مرات إضافية. بعد السماح للأنسجة بالاستقرار كما هو موضح للتو ، قم بتجميع المادة الطافية مع تعليق الخلية الأول ، وأضف 600 ميكرولتر أخرى من المخزن المؤقت إلى الحبيبات. بعد ذلك ، استخدم ماصة 0.4 ملم لترتيبات العينة ، وضع الأنبوب على الجليد لمدة دقيقتين للسماح للأنسجة بالاستقرار.

يعد اتباع خطوات الاختبار الميكانيكي في البروتوكول أمرا مهما لفرز ناجح. بعد ذلك ، اجمع المادة الطافية مع الخلايا المنفصلة. بعد ذلك، أضف 600 ميكرولتر من المخزن المؤقت A إلى العينة، وكرر عملية تصريف الماصة 0.4 ملم ثلاث مرات أخرى.

ضع الأنابيب على الجليد لمدة دقيقتين للسماح للخلايا بالاستقرار. وبعد ذلك ، قم بتجميع المادة الطافية في أنبوب ثان سعة 15 مل. كرر عملية التخلي ثلاث مرات أخرى ، باستخدام أصغر ماصة زجاجية ، مما يزيد بشكل كبير من إنتاجية الخلايا للفرز اللاحق.

بعد جمع جميع المواد الطافية ، أضف 800 ميكرولتر من سالب 20 درجة مئوية 100٪ إيثانول إلى أربعة أنابيب على الجليد. بعد ذلك ، انقل 800 ميكرولتر من الخلايا من الأنبوب الأول للطافية المجمعة إلى كل من أول أنبوبين من الإيثانول و 800 ميكرولتر من الخلايا من الأنبوب الثاني من المادة الطافية إلى كل من الأنبوبين الأخيرين من الإيثانول. اقلب الأنابيب لخلط العينات.

بعد ذلك ، ضع العينات على الجليد لمدة 15 دقيقة ، مع الخلط عن طريق الانعكاس كل خمس دقائق. في نهاية الحضانة ، قم بالطرد المركزي للخلايا. بعد ذلك ، عند لمس جدار الأنبوب الدقيق فقط ، استخدم ماصة دقيقة لإزالة جميع ال 50 ميكرولترا من كل مادة طافية باستثناء آخر 50 ميكرولترا ببطء.

قم بتصفية كل من معلقي الخلية بشكل منفصل باستخدام زوجين مختلفين من مصافي الخلايا. ثم تكون الخلايا جاهزة لوضع العلامات بالأجسام المضادة ضد علامات الخلية ذات الأهمية والفرز عن طريق قياس التدفق الخلوي. يكشف تحليل عينات أنسجة المخ الطازجة والمجمدة عن وجود مجموعات صغيرة متجانسة من الخلايا العصبية ذات الحجم والحبيبات المتشابهة.

يمكن بوابات المجموعات الصغيرة المتجانسة لاستبعاد أي مجاميع خلوية ، ويمكن تحديد الخلايا العصبية من خلال إيجابية NeuN و DAPI. في كل من عينات الأنسجة الطازجة والمجمدة ، تكون مستويات NeuN mRNA أكبر بكثير في المجموعات السكانية الإيجابية ل NeuN مقارنة بالسكان سالبين NeuN. في المقابل ، فإن مستويات mRNA لعلامة الخلايا الدبقية والخلايا الدبقية قليلة التغصن أكبر في السكان سالبين NeuN منها في السكان الإيجابيين NeuN.

لوحظ اتجاه مماثل لارتفاع مستويات mRNA لعلامة الخلايا الدقيقة في السكان السلبين NeuN ، على الرغم من أن هذا لم يكن ذا دلالة إحصائية. علاوة على ذلك ، تكون مستويات الحفرة المرسال المرسال أكبر في الخلايا العصبية الإيجابية للعفرة منها في الخلايا العصبية السالبة Fos ، مع زيادة ثلاثة أضعاف في Fos mRNA في الخلايا العصبية الإيجابية من الأنسجة الطازجة ، وزيادة أحد عشر ضعفا في Fos mRNA في الخلايا العصبية إيجابية Fos من الأنسجة المجمدة ، مما يؤكد صحة طريقة تحديد جينات معينة ذات أهمية من الخلايا المرتبة بالتدفق في ظل ظروف الأنسجة الطازجة والمجمدة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر اتباع خطوات الوقاية من تحلل الخلايا الحرجة.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل فرز الخلايا المنشطة بالفلورة لعزل المجموعات الفرعية للخلايا ذات الأهمية لمزيد من التحليل الجزيئي النهائي. يسمح استخدام الأنسجة المجمدة بفرز العينات في أيام منفصلة ، وهو أمر بالغ الأهمية للتجارب التي تنطوي على إجراءات طويلة ومعقدة لحصاد الأنسجة وتحضيرها. يمكن أيضا استخدام هذه التقنية لإعداد عينات الدماغ البشري المجمدة بعد الوفاة المخزنة لعدة أشهر أو سنوات للفرز عن طريق قياس التدفق الخلوي.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأعصاب لاستكشاف الآليات الجزيئية الكامنة وراء سلوك الخلايا العصبية التي تعبر عن Fos أو غيرها من الخلايا البرية ذات العلامات المناعية ذات الأهمية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية فصل الخلايا عن أنسجة دماغ الفئران الطازجة أو المجمدة لفرز الخلايا المنشطة بالفلورة للخلايا العصبية أو أنواع الخلايا ذات الأهمية.