الطبقات الجيني التركيبات: منصة لالمشارك ثقافة بالسكان خلية غير المتجانسة

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء أقراص من هيدروجيل الألجينات ثنائية الطبقات بشكل قابل للتكرار، وذلك لبحث العلاقات بين المجموعات الخلوية المختلفة أثناء الزراعة المشتركة ثلاثية الأبعاد (3D co-culture). تسهل هذه الطريقة دراسة التفاعلات بين مجموعات خلوية متعددة في مزارع ثلاثية الأبعاد غير متجانسة مكانيًا، مما قد يساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في هندسة الأنسجة وفيزيولوجيا الأنسجة الحاملة للأحمال. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها توفر طريقة مباشرة واقتصادية وقابلة للتكرار لإنشاء هيدروجيل ألجينات متعدد الطبقات ومستزرع بالخلايا، ويكون مهيأً هيكليًا للتحفيز الميكانيكي.

ستقوم بتقديم هذا الإجراء بونام شارما، وهي طالبة دراسات عليا من مختبري. لتشكيل أقراص الألجينات، قم أولاً بوضع قطعة من ورق ترشيح سميك فوق لوحة طرفية مقاس 3 في 3 بوصات، يتبعها غشاء مصفاة مجهرية للخلايا. استخدم ملعقة معقمة لتسوية الغشاء وورق الترشيح.

بعد ذلك، اقلب المجموعة فوق كومة من المناشف الورقية واضغط المواد لإزالة محلول كلوريد الكالسيوم الزائد. ثم، ضع قالباً لتشكيل الهلام يحتوي على آبار أسطوانية فوق غشاء المصفاة الدقيقة (microsieve membrane)، واستخدم مشابك تثبيت لتثبيت القالب برفق في اللوحة الطرفية من الجانبين الأيمن والأيسر. والآن، ضع قطعة من ورق الترشيح السميك فوق لوحة طرفية صغيرة، تليها قطعة من غشاء المصفاة الدقيقة، ثم اقلب المجموعة لإزالة أي كمية زائدة من كلوريد الكالسيوم، كما تم توضيحه للتو.

عندما يصبح نصفا القالب جاهزين، أعد تعليق 10⁶ خلية من الخلايا المستهدفة لكل ملليلتر من وسط ألجينات معقم. سيبدو الخليط عكراً بشكل متجانس عندما تتوزع الخلايا بشكل مناسب. بعد ذلك، انقل 130 µL من الخلايا قطرة تلو الأخرى في الآبار المنفردة الموجودة في النصف السفلي من هيكل القالب، والتي يبلغ قطرها 6 mm وارتفاعها 3 mm.

يجب أن يكون هناك تقعر محدب طفيف مرئي فوق حافة كل بئر. بعد استزراع جميع الخلايا، استخدم ملعقة مختبرية معقمة لتسوية النصف العلوي من هيكل القالب بعناية. بعد ذلك، اقلب القالب بحيث تكون غشاء المصفاة الدقيقة فوق الآبار، وضع القالب فوق الآبار، مع الحرص على تغطية الآبار التي تحتوي على خلائط الخلايا والألجينات بشكل كامل.

عندما يصبح القالب في موضعه، ارفع هيكل القالب المُحمّل، وبالضغط بقوة على المركز، ضع مشابك تثبيت على الجانبين المتبقيين من الهيكل لتثبيت النصفين العلوي والسفلي من القالب. يجب أن تكون محاليل ألجينات الخلايا مستقرة بإحكام في الآبار. بعد ذلك، اغمر هيكل القالب بالكامل في حمام كلوريد الكالسيوم بتركيز 102 millimolar داخل غطاء زراعة الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة.

في نهاية فترة التحضين، انقل البنية إلى مجموعة من المناشف الورقية وقم بإزالة مشبكي التثبيت اللذين يثبتان اللوحة الطرفية العلوية بالقالب. افصل نصفي البنية. يجب ألا تحتوي الهيدروجيلات المتكونة في الآبار على أي فقاعات، ويجب أن تملأ الآبار بالكامل.

قم بإزالة مشبكي الورق المتبقيين وافصل القالب الذي يحتوي على الهيدروجيل عن اللوحة الطرفية المتبقية. وباستخدام ملعقة مسطحة (spatula)، تتبع بعناية حواف الآبار التي تحتوي على الهيدروجيلات لتحرير الهلامات بحذر. بعد ذلك، انقل الهيدروجيلات مباشرة إلى حمام من DPBS يحتوي على كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم.

بعد مرور دقيقة إلى خمس دقائق، انقل الهيدروجيلات إلى آبار منفصلة في طبق مكون من ستة آبار يحتوي على كمية كافية من محلول وسط نمو الريحان لغمر الجيلات بالكامل لمدة ساعة واحدة على الأقل عند 37 درجة Celsius و5% CO2. خلال الثلاثين دقيقة الأخيرة من الحضن، استخدم مشابك ربط لتثبيت القالب الذي يحتوي على آبار يبلغ ارتفاعها نصف ارتفاع قالب تشكيل الجيلات في لوح النهاية الألمنيوم بمقاس 3 في 3 بوصة أو 3 في 1.5 بوصة على الجانبين الأيمن والأيسر لإنشاء قالب قطع. ثم قم بإنشاء وضع التلدين عن طريق تثبيت القالب الذي يحتوي على آبار بقطر أكبر بـ 3 mm من قطر آبار قالب تشكيل الجيلات في ألواح نهاية ألمنيوم بمقاس 3 في 3 بوصة على الجانبين الأيمن والأيسر.

الآن، انقل الهيدروجيلات إلى آبار قالب القطع. يجب أن يستقر كل جيل بإحكام داخل البئر مع بروز نصف الجيل فوق القالب. واستخدم المشرط للقطع على طول سطح القالب لقص الهيدروجيل إلى نصفين.

اقلب النصف العلوي من الهلام وضعه في فجوة قالب مفتوحة. يجب أن يتناسب جزء الهلام بإحكام داخل الفجوة، بحيث يصبح كلا النصفين الآن بطول القالب، مع ظهور السطح الداخلي المقطوع. بعد ذلك، ضع قطعة من غشاء مجهري خلوي جاف (dry cell microsieve membrane) فوق الفجوات، مع التأكد من ملامسة الغشاء لجميع أنصاف الهلام المراد دمجها، ثم غطِّ الغشاء بقطعة من ورق ترشيح سميك.

عندما يتم تغطية الهلامات بالكامل، قم بتشبيع ورقة الترشيح بسترات الصوديوم المدعمة بـ EDTA، واترك الهلامات في الحضانة بدرجة حرارة الغرفة. بعد دقيقة واحدة، تخلص من غشاء المنخل المجهري للخلايا وورقة الترشيح السميكة، وقم بإزالة مشابك التثبيت. بعد ذلك، افتح القالب وانقل نصف الهلام إلى قالب تلدين مُعد مسبقاً بحيث يكون السطح المقطوع مواجهاً للأعلى.

باستخدام ملعقة مختبر، انقل النصف الثاني من الهلام المعالج فوق الهلام الأول، بحيث يكون السطح المقطوع ملامساً للسطح المقطوع للهلام الأول. وعندما يتم وضع جميع قطع الهلام، استخدم ملعقة مختبر للضغط لأسفل برفق على الهلام لإزالة أي فقاعات، ثم اغمر قالب التلدين بعناية في حمام كلوريد الكالسيوم. وبعد مرور 30 دقيقة، انقل قالب التلدين إلى كومة من المناشف الورقية وأزل مشابك الربط.

بعد ذلك، افصل القالب عن اللوحة الطرفية وانقل الهلامات لفترة وجيزة إلى حمام من DPBS، ثم اغمرها في وسط زراعة الخلايا المناسب. تظهر هلامات الطبقة الثنائية المكتملة انفصالاً أولياً تاماً بين المجموعات الخلوية، كما هو ملاحظ في هذه الصورة لخلايا 293 FT المصبوغة بصبغات تتبع الخلايا الخضراء أو الحمراء. وتكون حيوية الخلايا الجذعية الميزنكيمية البشرية المدمجة بعد عملية التلدين عالية داخل الهلامات المائية الطبقية، بشكل مشابه لحيوية الخلايا الملاحظة في الهلامات المائية الكتلية.

بعد عزل ذروة الإجهاد من كل دورة خلال ضغط دوري غير مقيد لمدة أربع ساعات، تظهر الهيدروجيلات الطبقية الخالية من الخلايا استجابة للإجهاد تجاه الضغط الدوري تكون أقل بشكل ملحوظ في المقدار مقارنة بالهيدروجيلات غير الطبقية الكتلية الخالية من الخلايا، على الرغم من بقاء كلا النوعين من الهيدروجيل سليمين بعد سبعة أيام في المزرعة. وبمجرد إتقان هذه التقنية، بما في ذلك تحضير جميع المواد، يمكن إكمالها في أقل من أربع ساعات ونصف إذا نُفذت بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم العمل بتأنٍ وببطء لمنع حدوث أي أخطاء، ولتسهيل تتبع العينات المختلفة.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل التحفيز الميكانيكي والتلوين المناعي للإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بالتفاعلات بين المجموعات الخلوية المختلفة في المصفوفات خارج الخلية التي قد تتشكل. ستتيح هذه التقنية للباحثين في مجال علم الأحياء الميكانيكي وهندسة الأنسجة استقصاء العلاقة بين المجموعات الخلوية المختلفة بسهولة أكبر، مثل الخلايا الجذعية الميزنكيمية، والخلايا الغضروفية، وخلايا النواة اللبية. ولا تنسَ أن العمل مع الأدوات الحادة، والمواد البيولوجية، وخاصة الخلايا البشرية، قد يكون خطيراً للغاية، لذا يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة مثل ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.