عالية الإنتاجية تحديد البكتيريا البوليمرات طارد للمستلزمات الطبية

الهدف العام من تقنية المصفوفات الدقيقة البوليمرية هذه هو تحديد البوليمرات الاصطناعية القادرة على تعديل ارتباط البكتيريا بالأسطح غير الحيوية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في تسريع التقدم في اكتشاف مواد حيوية بسيطة وفعالة من حيث التكلفة تمنع ارتباط البكتيريا بالأجهزة الطبية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بأبحاث المواد الحيوية التقليدية التي تختبر مادة واحدة في كل مرة هي قدرتها على فحص مئات البوليمرات في وقت واحد في أصل واحد.

للبدء، قم بتحضير محاليل البوليمر وأضفها إلى آبار طبق يحتوي على 384 بئرًا، وفقًا للبروتوكول المكتوب. أنشئ إجراءً لطباعة البوليمرات في رباعيات تتكون من 1536 نقطة، مرتبة في 48 صفًا و 32 عمودًا، مع طباعة 32 محلول بوليمر في المرة الواحدة حتى يمكن إيقاف الطابعة بعد طباعة كل قسم للسماح بتنظيف الدبابيس. الآن، ضع الشرائح المطلية بالأجاروز على المنصة وتأكد من إحكام سد الفراغ لضمان تثبيت الشرائح في موضعها.

لضبط رأس الطباعة بحيث تكون جميع الدبابيس على نفس الارتفاع، خفّض الرأس يدويًا فوق شريحة زجاجية وتأكد من أن الدبابيس ترتفع في وقت واحد. ضع صفيحة الآبار على حامل الصفائح بحيث تكون البئر A1 في أعلى يمين الحامل، وتأكد من تثبيت صفيحة الآبار بإحكام. أكّد أن الشريحة وصفيحة الآبار في موضعهما عند ظهور المطالبة بذلك.

قم بطباعة قسم واحد في كل مرة، مع السماح بتنظيف المسامير بين الأقسام. ثم استخدم منديلاً ورقياً مغموساً في الأسيتون لتنظيف المسامير جيداً، يليه استخدام مناديل ورقية جافة للتأكد من جفاف المسامير تماماً.

عندما تكتمل عملية طباعة المصفوفات الدقيقة، ضعها في حامل شرائح وانقلها إلى فرن تفريغ، مضبوط على 40 °C للتجفيف، وذلك لإزالة N&P من البقع البوليمرية. بعد ذلك، استخدم الأشعة فوق البنفسجية لتعقيم الشرائح لمدة 30 دقيقة. وقبل تلقيح الشرائح بالبكتيريا، قم بقياس الفلورة الخلفية وفقاً للبروتوكول المكتوب.

بعد استزراع وتحضير اللقاحات للمصفوفات الدقيقة، وفقًا للبروتوكول المكتوب، ضع المصفوفات الدقيقة البوليمرية المعقمة بالأشعة فوق البنفسجية في أطباق مستطيلة ذات أربعة آبار وأضف 6 mL من المزارع البكتيرية المختلطة. حضن الأطباق عند 37 °C مع الرج الخفيف لمدة خمسة أيام. بعد التحضين، استخدم PBS لشطف المصفوفات الدقيقة بلطف مرتين.

ثم أضف 1 µg/mL من DAPI في PBS واحضن العينة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، انقل المصفوفات الدقيقة إلى طبق جديد مكون من أربع آبار، وغطِّ المصفوفات الدقيقة بـ PBS ثم حركها بلطف. ثم استبدل PBS مرة واحدة وكرر عملية الغسل.

بعد الشطف، جفف المصفوفات الدقيقة تحت تيار من الهواء، ثم ضع فيلم الختم وثبت شرائح غطاء زجاجية على شرائح المصفوفة الدقيقة. وعندما يجف الغراء، استخدم ethanol بتركيز 70% لتعقيم السطح الخارجي. وباستخدام مجهر فلوري، مجهز بعدسة شيئية 20x، التقط صوراً فردية لكل بقعة بوليمر في الحقل المضيء والقنوات الشريطية.

لتغطية الشرائح الغطائية بالبوليمرات، قم بتحضير محاليل من بوليمرات HIT في رباعي هيدرو الفوران أو أي مذيب آخر مناسب. وباستخدام جهاز طلاء دوراني، قم بطلاء شرائح غطائية زجاجية دائرية ذات حجم مناسب بمحاليل البوليمر بسرعة 2000 RPM لمدة عشر ثوانٍ. جفف الشرائح الغطائية المطلية في فرن حمل حراري عند 40 degrees celsius طوال الليل.

واستخدم الأشعة فوق البنفسجية لتعقيم شرائح التغطية لمدة 30 دقيقة قبل التلقيح بالبكتيريا. ضع شرائح التغطية المعقمة بالأشعة فوق البنفسجية في طبق قياسي مكون من 12 أو 24 بئراً وقم بتحضينها مع البكتيريا كما تم توضيحه سابقاً في هذا الفيديو. وبعد التحضين، استخدم محلول cacodylate buffer بتركيز 0.1 molar لغسل شرائح التغطية المطلية مرتين، ثم قم بتثبيت العينات لمدة ساعتين باستخدام glutaraldehyde بتركيز 2.5% weight per volume و cacodylate buffer بتركيز 0.1 molar.

قم بتثبيت الشرائح الغطائية باستخدام 1% رباعي أكسيد الأوزميوم لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. قبل ذلك، يتم تجفيفها في سلسلة من الإيثانول لمدة 30 دقيقة عند كل تركيز. ثم باستخدام جهاز طلاء بالترذيذ ومزيج سبيكة من الذهب والبلاتين بنسبة 60 إلى 40%، قم بطلاء العينات باستخدام تيار قدره 30 milliamps وتفريغ هوائي قدره 0.75 torr.

بعد التقاط الصور باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM)، قارن بصرياً بين صور الشرائح الزجاجية غير المطلية وتلك المطلية بالأغاروز أو بوليمرات HIT لتأكيد قدرات البوليمرات على ربط البكتيريا أو طردها. ولتقييم مدى توافق المذيبات المختلفة مع الجزء الطرفي من القسطرة، فضلاً عن قدرتها على إذابة بوليمر HIT، اغمر قطع القسطرة في المذيبات واتركها لمدة 12 ساعة قبل التقييم البصري لسلامة القسطرة وصفاء المذيب. ولتحليل التصاق البكتيريا على القساطر بواسطة المجهر الإلكتروني الماسح (SEM)، قم بتحضير محلول بوليمر بتركيز 10% في الأسيتون.

اضغط بطرف ماصة دقيقة سعة 200 µL في الجزء الأوسط من القطعة المقطوعة من القسطرة لتثبيتها، ثم اغمس القطعة في محلول البوليمر لمدة 30 ثانية تقريبًا. جفف القطعة المطلية في الظروف المحيطة لمدة 30 دقيقة، ثم ضع طبقة طلاء ثانية عن طريق غمر قطعة القسطرة مرة أخرى في محلول البوليمر وتجفيفها طوال الليل في الظروف المحيطة. بعد تحضين قطع القسطرة المطلية وغير المطلية في وسط LB ملقح، وفقًا للبروتوكول المكتوب، استخدم 1 mL من PBS لغسل القسطرة.

ثم استخدم 10%paraformaldehyde في PBS لتثبيت البكتيريا لمدة 30 دقيقة. وبعد الغسل باستخدام PBS، استخدم DAPI لصبغ البكتيريا الموجودة على قطع القسطرة لمدة 20 دقيقة. وذلك قبل الغسل بـ 1 mL من PBS.

لاحظ ترتيب العينات في الحجرة. وباستخدام الإعدادات التالية، التقط صورًا مجهرية بؤرية (confocal images) لقطع القثطار. وأتمم التصوير البؤري عن طريق تجميع 50 صورة في مكدس محوري (z-stack) على طول 100 micrometer من القثطار.

بعد المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية والتحضين مع البكتيريا، استخدم 1 mL من PBS لغسل القطع مرتين، ثم انقلها إلى أطباق ذات 48 بئراً تحتوي على 10% formaldehyde في PBS لمدة 30 دقيقة. وبعد تثبيت العينات، قم بإجراء غسلة أخرى باستخدام PBS واتركها لتجف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. ثم ثبتها على قواعد تثبيت مزودة بأقراص كربون موصلة واستخدم جهاز طلاء بالترذيذ لطلائها بالذهب.

قبل التصوير باستخدام مجهر إلكتروني ماسح. يوضح هذا الشكل ارتباط البكتيريا بعدد من البوليمرات كما تم تحديده بواسطة تحليل المصفوفة الدقيقة. تعمل البقع المطبوعة بدون بوليمر كضابط سلبي لأن agarose يقاوم ارتباط البكتيريا بقوة، وبالتالي يكون الفلورة منخفضاً جداً.

تُظهر البوليمرات المعروضة ارتباطاً بالسبائك، ومع ذلك، تختلف خصائص التنافر للبوليمر بشكل كبير بين الأنواع البكتيرية التي تم اختبارها في معظم الحالات. ويعكس هذا الاختلافات الواسعة في آليات الالتصاق عبر الأنواع المختلفة. ويمكن تحديد البوليمرات ذات الارتباط المنخفض بسهولة من خلال المقارنة مع الآغاروز.

من المرجح تحديد البوليمرات ذات الارتباط العالي في المصفوفة، ويمكن استخدامها كضوابط إيجابية للتجارب اللاحقة. بالنسبة للبوليمرات التي لا تظهر فلورة ذاتية في قناة DAPI، يمكن إجراء مقارنة نوعية لصور البقع بصرياً. وقد أُجريت تجارب توسيع النطاق لاختبار طلاء أسطح أكبر للتأكد من خصائص طرد البكتيريا لـ 22 بوليمراً مناسباً تم تحديدهم.

تظهر هنا أفضل العينات أداءً والتي استُخدمت لطلاء شرائح التغطية الزجاجية كما تم تحليلها بواسطة المجهر الإلكتروني الماسح (SEM). وتوضح هذه الأشكال مقاطع عرضية من القسطرة تم تحليلها بواسطة المجهر البؤري والمجهر الإلكتروني الماسح. وتتميز كلتا الطريقتين المجهريتين بإمكانية إجراء عد مباشر للخلايا على السطح، مما يوفر بيانات غير غامضة حيث يسهل رؤية الانخفاض في التصاق الخلايا.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن اختبار مكونات المصل أو الدم لتحديد تأثيرها على الارتباط البكتيري. كما يمكن استخدام نموذج حيواني لتقييم إمكانية استخدام طلاءات البوليمر في التطبيقات السريرية. لا تنسَ أن العمل مع المواد الكيميائية والكائنات الممرضة قد يكون خطيراً.

ويجب تطبيق الضوابط الضرورية أثناء التعامل والتخلص من المواد للحد من المخاطر الشخصية والبيئية.