عالية الإنتاجية تحديد البكتيريا البوليمرات طارد للمستلزمات الطبية

الهدف العام من تقنية المصفوفات الدقيقة للبوليمر هو تحديد البوليمرات الاصطناعية القادرة على تعديل ارتباط البكتيريا بالأسطح اللاأحيائية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في تسريع التقدم في اكتشاف مواد حيوية بسيطة وفعالة من حيث التكلفة تمنع الارتباط البكتيري بالأجهزة الطبية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بأبحاث المواد الحيوية التقليدية لاختبار مادة واحدة في كل مرة هي قدرتها على فحص مئات البوليمرات في وقت واحد في أصل واحد.

للبدء ، قم بإعداد محاليل البوليمر وإضافتها إلى آبار صفيحة 384 بئرا ، وفقا لبروتوكول النص. قم بإنشاء روتين لطباعة البوليمرات في أربع مرات يتكون من 1536 نقطة ، مرتبة على شكل 48 صفا و 32 عمودا ، وطباعة 32 محلولا بوليمر في المرة الواحدة بحيث يمكن إيقاف الطابعة بعد طباعة كل قسم للسماح بتنظيف المسامير. الآن ضع الشرائح المطلية بالأغاروز على المنصة وتأكد من ختم فراغ جيد لتثبيت الشرائح في موضعها.

لضبط رأس الطباعة بحيث تكون جميع المسامير على نفس الارتفاع، قم بخفض الرأس يدويا على شريحة زجاجية وتأكد من تحرك المسامير لأعلى في نفس الوقت. ضع لوحة البئر على حامل اللوحة مع البئر A1 في الجزء العلوي الأيمن من الحامل وتأكد من تثبيت لوحة البئر بإحكام. تأكد من أن الشريحة ولوحة البئر في موضعهما عند مطالبتك بذلك.

اطبع قسما واحدا في كل مرة ، مما يسمح بتنظيف المسامير بين الأقسام. ثم استخدم منشفة ورقية مغموسة في الأسيتون لتنظيف المسامير جيدا. متبوعا بالمناديل الورقية الجافة لضمان جفاف المسامير تماما.

عندما تتم طباعة المصفوفات الدقيقة بالكامل ، ضعها في حامل شرائح وانقلها في فرن مفرغ من الهواء ، على درجة حرارة 40 درجة مئوية حتى تجف ، لإزالة N & P في بقع البوليمر. ثم استخدم ضوء الأشعة فوق البنفسجية لتعقيم الألواح لمدة 30 دقيقة. قبل تلقيح الشرائح بالبكتيريا ، قم بقياس مضان الخلفية وفقا لبروتوكول النص.

بعد زراعة وإعداد اللقاحات للمصفوفات الدقيقة ، وفقا لبروتوكول النص ، ضع المصفوفات الدقيقة للبوليمر المعقمة بالأشعة فوق البنفسجية في ألواح مستطيلة بأربعة آبار وأضف ستة ملليلتر من المزارع البكتيرية المختلطة. احتضن الصفائح عند 37 درجة مئوية مع تحريك لطيف لمدة خمسة أيام. بعد الحضانة ، استخدم PBS لشطف المصفوفات الدقيقة برفق مرتين.

ثم أضف ميكروغراما واحدا لكل مليلتر من DAPI في PBS واحتضنه لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، انقل المصفوفات الدقيقة إلى لوحة جديدة من أربعة آبار ، وقم بتغطية المصفوفات الدقيقة باستخدام PBS ثم قم بالتدوير برفق. ثم قم بتغيير PBS مرة واحدة وكرر الغسيل.

بعد الشطف ، جفف المصفوفات الدقيقة تحت تدفق الهواء ثم ضع طبقة مانعة للتسرب وقم بلصق زلات الغطاء الزجاجي على شرائح المصفوفة الدقيقة. عندما يجف الغراء ، استخدم 70٪ من الإيثانول لتعقيم السطح الخارجي. باستخدام مجهر مضان ، مزود بشخصية 20x ، التقط صورا مفردة لكل بقعة بوليمر في مجال ساطع وقنوات أردية.

لطلاء زلات الغطاء بالبوليمرات ، قم بإعداد محاليل بوليمرات HIT في رباعي هيدروفوران أو مذيب مناسب آخر. باستخدام آلة طلاء الدوران ، قم بتدوير غطاء زجاجي دائري بحجم مناسب مع محاليل البوليمر عند 2000 دورة في الدقيقة لمدة عشر ثوان. جفف الغطاء المطلي في فرن حراري على حرارة 40 درجة مئوية طوال الليل.

واستخدم ضوء الأشعة فوق البنفسجية لتعقيم زلات الغطاء لمدة 30 دقيقة قبل التلقيح بالبكتيريا. ضع زلات الغطاء المعقمة بالأشعة فوق البنفسجية في صفيحة قياسية من 12 أو 24 بئر واحتضانها بالبكتيريا كما هو موضح سابقا في هذا الفيديو. بعد الحضانة ، استخدم 0.1 مولار كاكوديلات عازلة لغسل زلات الغطاء المطلي مرتين ثم بوزن 2.5٪ لكل حجم جلوتارالديهايد و 0.1 مولار كاكوديلات عازلة ، قم بإصلاح العينات لمدة ساعتين.

إصلاح الغطاء ينزلق مع 1٪ رابع أكسيد الأوزميوم لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. قبل تجفيفها في سلسلة الإيثانول لمدة 30 دقيقة عند كل تركيز. ثم باستخدام طلاء الرش وخليط من الذهب إلى سبائك البلاتين بنسبة 60 إلى 40٪ ، قم بتغطية العينات باستخدام تيار 30 مللي أمبير وفراغ 0.75 تور.

بعد التقاط الصور باستخدام SEM ، قارن بصريا صور زلات الغطاء غير المطلية وتلك المطلية ببوليمرات الاغاروز أو HIT لتأكيد قدرات الارتباط البكتيري أو الصد للبوليمرات. لتقييم المذيبات المختلفة للتوافق مع جزء الحفر النهائي من القسطرة ، بالإضافة إلى قدرتها على إذابة بوليمر HIT ، اغمر قطع القسطرة في المذيبات واحتضانها لمدة 12 ساعة قبل التقييم البصري لسلامة القسطرة ووضوح المذيب. لتحليل الارتباط البكتيري على القسطرة بواسطة SEM ، قم بإعداد محلول بوليمر بنسبة 10٪ في الأسيتون.

اضغط على طرف ماصة دقيقة سعة 200 ميكرولتر في الجزء الأوسط من القطعة المقطوعة من القسطرة لتثبيتها ولصق القطعة في محلول البوليمر لمدة 30 ثانية تقريبا. جفف القطعة المطلية في الظروف المحيطة لمدة 30 دقيقة ثم ضع طبقة ثانية عن طريق غمر قطعة القسطرة مرة أخرى في محلول البوليمر وجففها طوال الليل في ظل الظروف المحيطة. بعد احتضان قطع القسطرة المطلية وغير المطلية في LB الملقح ، وفقا لبروتوكول النص ، استخدم ملليلتر واحد من PBS لغسل القسطرة.

ثم استخدم 10٪ بارافورمالدهيد في PBS لإصلاح البكتيريا لمدة 30 دقيقة. بعد الغسيل باستخدام PBS ، استخدم DAPI لتلطيخ البكتيريا الموجودة على قطع القسطرة لمدة 20 دقيقة. قبل الغسيل بملليلتر واحد من PBS.

راقب ترتيب العينات في الغرفة. باستخدام الإعدادات التالية ، التقط صورا متحدة البؤر لقطع القسطرة. أكمل التصوير متحد البؤر عن طريق تكديس 50 صورة على طول 100 ميكرومتر من القسطرة.

بعد المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية وحضانة البكتيريا ، استخدم ملليلتر واحد من PBS لغسل القطع مرتين ونقلها إلى 48 بئرا تحتوي على 10٪ فورمالديهايد في PBS لمدة 30 دقيقة. بعد إصلاح العينات ، قم بغسل آخر باستخدام PBS وجففه طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بتثبيته على بذرة بأقراص كربونية موصلة واستخدم طلاء الرش لطلاء ذهبي.

قبل التصوير ، باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح. يوضح هذا الشكل الارتباط البكتيري بعدد من البوليمرات كما هو محدد من خلال تحليل المصفوفات الدقيقة. تعمل البقع المطبوعة بدون بوليمر كعنصر تحكم سلبي حيث يقاوم الاغاروز بقوة الارتباط البكتيري وبالتالي يكون التألق منخفضا جدا.

البوليمرات المعروضة عبارة عن سبائك ملزمة ، على الرغم من أن الخصائص الطاردة للبوليمر تختلف اختلافا كبيرا في معظم الحالات بين الأنواع البكتيرية التي تم اختبارها. هذا يعكس الاختلافات الواسعة بين آليات التعلق عبر الأنواع المختلفة. يمكن التعرف بسهولة على البوليمرات منخفضة الارتباط بالمقارنة مع الاغاروز.

من المحتمل أن يتم تحديد البوليمرات عالية الارتباط في مصفوفة ويمكن استخدامها كعناصر تحكم إيجابية للتجارب اللاحقة. بالنسبة للبوليمرات التي لا تظهر التألق التلقائي في قناة DAPI ، يمكن إجراء مقارنة نوعية للصور الموضعية بصريا. تم إجراء تجارب توسيع النطاق لاختبار طلاء الأسطح الأكبر لتأكيد خصائص طارد البكتيريا ل 22 بوليمر مناسب تم تحديده.

كما هو موضح هنا ، هي أفضل العينات أداء المستخدمة لطلاء زلات الغطاء الزجاجي كما تم تحليلها بواسطة SEM. تظهر هذه الأرقام شرائح القسطرة التي تم تحليلها بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر و SEM. تتمتع كلتا الطريقتين المجهريتين بميزة السماح بتعداد الخلايا المباشر على السطح ، مما يوفر بيانات لا لبس فيها ، حيث يمكن رؤية تقليل ارتباط الخلايا بسهولة.

بعد هذا الإجراء ، يمكن اختبار المصل أو مكونات الدم لتحديد تأثيرها على الارتباط البكتيري. يمكن استخدام نموذج حيواني من أجل تقييم إمكانات طلاء البوليمر للاستخدام السريري. لا تنس أن العمل مع المواد الكيميائية والكائنات المسببة للأمراض يمكن أن يكون خطيرا.

ويجب وضع الضوابط اللازمة أثناء المناولة والتخلص منها للتخفيف من المخاطر الشخصية والبيئية.