تنقية مجمعات الأصلية للدراسة الهيكلية باستخدام طريقة العلامة جنبا الى جنب الانجذاب

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تنقية مركب جزيئي أصلي بجودة مناسبة للدراسات الفيزيائية الحيوية. لا يعمل هذا البروتوكول كوسيلة لتنقية المركب فحسب ، بل كدليل مفصل لتقييم الجودة الهيكلية للعينة أثناء التنقية. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي أنه يسمح للمرء بتنقية مجموعة أصلية في ظل ظروف عازلة فسيولوجية قريبة ببساطة وبسرعة ، وذلك لضمان التجانس التركيبي.

بعد الطرد المركزي لخلايا S.cerevisiae ، وصب المادة الطافية وفقا لبروتوكول النص ، أضف ملليلترين من محلول التحلل المبرد ، وقم بتدوير و / أو استخدام ماصة 10 ملليلتر لتعليق الحبيبات. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي الشكل من مادة البولي بروبيلين فارغة سعة 50 مليلتر محفوظ على الجليد. ثم استخدم ملليلترين إضافيين من محلول التحلل المبرد لغسل كل زجاجة طرد مركزي وإضافة المحلول إلى أنبوب 50 ملليلترا.

بعد تحديد الوزن الرطب لحبيبات الخلية ، قم بإنشاء حمام نيتروجين سائل داخل وحول أنبوب طرد مركزي مخروطي الشكل من مادة البولي بروبيلين سعة 50 مل. بعد ذلك ، ارسم الخلايا العالقة في حقنة سعة خمسة ملليلتر وقم بتوصيل إبرة قياس 16 بالمحقنة. بعد ذلك ، قم بتجميد تعليق الخلية عن طريق تمريره عبر المحقنة والإبرة في الحمام بمعدل واحد تقريبا مليلتر واحد في الدقيقة لتوليد قطرات.

لتحلل خلايا الخميرة ، ابدأ باستخدام النيتروجين السائل لتبريد مطحنة القهوة مسبقا. ثم أضف ما يصل إلى 40 جراما من خلايا الخميرة وطحنها لمدة 25 ثانية ، وكرر الطحن ثماني أو تسع مرات. يوصى بعدم تنقية أكثر من 10 لترات من زراعة الخلايا في وقت واحد.

هذا يقلل من وقت التنقية ويضمن الحفاظ على السلامة الهيكلية للمجمع. بعد كل جولتين من الطحن ، أضف طبقة ضحلة من النيتروجين السائل إلى المطحنة واتركها تتبخر. لمنع الخلايا من التكتل ، امنع الخلايا من الذوبان باستخدام ملعقة مبردة بالنيتروجين السائل لتحريك الخلايا.

بعد التحلل ، يجب أن تظهر الخلايا كمسحوق أبيض ناعم. بعد فحص تحلل الخلية وإعداد المخزن المؤقت للتحلل باستخدام مثبطات PMSF و DTT والبروتياز وفقا لبروتوكول النص ، استخدم ملعقة مبردة بالنيتروجين السائل لغرف مسحوق الخلية المحللة المجمدة بشكل تدريجي في أنابيب 50 مليلتر المحضرة من المخزن المؤقت. مع كل زيادة إضافية ، قم بتدوير الأنابيب سعة 50 ملليلتر برفق في درجة حرارة الغرفة لإذابة الخلايا وإذابتها ومنع تكون الفقاعات.

عندما تذوب الخلايا ، أضف المزيد من مسحوق الخلية. بعد إضافة جميع الخلايا ، استمر في إذابة الخلايا وإذابتها حتى لا تلاحظ كتل الخلايا المجمدة في الأنابيب. يجب أن يستغرق هذا حوالي 50 دقيقة.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لتحلل الخلية عند 25 ، 000 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. بمجرد تحلل الخلايا وبعد الطرد المركزي ، قد تلاحظ طبقة مظلمة صغيرة في الحبيبات غير القابلة للذوبان. انقل المادة الطافية إلى أنابيب الطرد المركزي الفائق من البولي كربونات وأضف 10 ميكرولتر من 200 مللي مولار PMSF إلى كل أنبوب كامل.

الطرد المركزي العينات عند 100 ، 000 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة. في نهاية الدوران ، يجب أن تكون أربع طبقات مرئية. حبيبات صلبة واضحة تحتوي في الغالب على مجمعات ريبوسومي. بيليه ناعم غني بالدهون ؛ طبقة كبيرة وواضحة ذات صبغة صفراء تحتوي على معظم البروتينات والمجمعات القابلة للذوبان في الخلية. وطبقة علوية متقشرة تتكون من الدهون.

في غرفة باردة عند أربع درجات مئوية ، استخدم ماصة سعة مليلتر واحد لإزالة أكبر قدر ممكن من طبقة الدهون المتقشرة العلوية والتخلص منها. استخدم ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر لاستعادة معظم الطبقة الصفراء الصافية. بعد ذلك ، باستخدام ماصة سعة مليلتر واحد لتجنب إزعاج الطبقتين السفليتين ، استرجع آخر بضعة ملليلتر من هذه الطبقة.

من 40 جراما من حبيبات الخلية الرطبة ، عادة ما يتم استرداد ما يقرب من 48 مل من الطبقة الوسطى. بعد تحضير سيفاروز IgG وفقا لبروتوكول النص ، امزج راتنج IGG مع المادة الطافية في المرحلة الوسطى وقرصين صغيرين مثبطات للبروتياز لكل 40 جراما من الخلايا. ثم ضعه على دوار عند أربع درجات مئوية لمدة ساعتين.

هذا هو الحل الدفعي IgG. قم بإعداد عمودين من البولي التحضير سعة 10 ملليلتر عن طريق قطع نهايات الأعمدة لإنتاج فتحة مسطحة. صب 24 مل من ملاط راتنج IgG المعلق أو محلول الدفعات في كل عمود ، واتركه يترسب عن طريق الجاذبية.

هذا يتوافق مع 200 ميكرولتر من راتنج IgG المعبأ. إذا استغرق الترسيب أكثر من 30 دقيقة ، فقد تكون المرحلة الوسطى ملوثة بالدهون. عند اكتمال الترسيب ، استخدم أربعة أحجام متتالية سعة 10 مليلتر من المخزن المؤقت IgG D150 لغسل العمود المعبأ.

لإجراء انقسام فيروس حفر التبغ أو انقسام البروتياز TEV على العمود ، أغلق الجزء السفلي من العمود وأضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت IgG D150 و 100 ميكرولتر من بروتياز TEV. أغلق الجزء العلوي من العمود واستخدم الخلاط الحراري عند 750 دورة في الدقيقة و 18 درجة مئوية ، واخلطه لمدة 20 دقيقة. أعد تعليق الراتنج واخلطه مرة أخرى لمدة 20 دقيقة.

ثم أعد التعليق وكرر الخلط لمدة 20 دقيقة للمرة الثالثة. أعد العمود إلى أربع درجات مئوية واستخدم الجاذبية لتصفية مركب البروتين. ثم أضف 200 ميكرولتر من IgG D150 لتخفيف الحجم الميت.

بعد تحضير راتنج تقارب الكالمودولين وفقا لبروتوكول النص ، أضف المخزن المؤقت لربط الكالمودولين وعينة إلى الراتنج ، واستخدم دوار الأنبوب للاحتضان عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة. قم بإعداد عمود بولي بريب سعة ملليلترين لكل 100 ميكرولتر من ملاط الكالمودولين عن طريق قطع نهاية العمود لإنشاء فتحة مسطحة. يوضح البروتوكول تفاصيل المخزن المؤقت المحدد وأحجام الإقامة المختارة للحفاظ على تركيز المجمع وتقليل وقت بقاءه من الراتنج.

إذا تم تغيير الحجم الثقافي ، فمن المستحسن تغيير أحجام الراتنج والمخزن المؤقت لأعمدة الجاذبية لحساب التغيير. قم بتعبئة العمود بما لا يزيد عن 100 ميكرولتر من ملاط الكالمودولين وعن طريق الجاذبية ، استخدم 5 مل من المخزن المؤقت المرتبط بالكالمودولين لغسل الراتنج ثلاث مرات. باستخدام 200 ميكرولتر من محلول شطف الكالمودولين ، قم بإزالة البروتين ثلاث مرات.

بعد ذلك ، أغلق الجزء السفلي من العمود وأضف 20 ميكرولترا من محلول الشطف واحتضنه لمدة 2.5 دقيقة قبل تحرير الختم والسماح للبروتين بالتصفية عن طريق الجاذبية. أغلق الجزء السفلي من العمود مرة أخرى وأضف 200 ميكرولتر من محلول الشطف قبل الحضانة لمدة خمس دقائق. ثم قم بفك الجزء السفلي من العمود وقم بإزالة المحلول.

بالنسبة للشطف السادس والأخير ، أغلق الجزء السفلي من العمود واحتضنه بمحلول شطف لمدة 10 دقائق. ثم قم بفك الختم والعزف. قم بإجراء تحليل ما بعد التنقية وتخزين العينات وفقا لبروتوكول النص.

كما هو موضح هنا ، أسفر التنقية الأولية بتقنية TAP للمركب باتباع بروتوكول منشور عن مركب هاجر على شكل ثلاثة نطاقات على هلام ملطخ بالفضة. تمنحنا الجولات المتعددة من تحسين طريقة TAP مركبا هاجر كفرقة واحدة على هلام أصلي ، مما يدل على تجميع أكثر تجانسا. تمشيا مع نتيجة الهلام الأصلية ، اكتشف النشاف الغربي باستخدام جسم مضاد TAP ضد المركب ، المنقى وفقا للبروتوكول المنشور ، التحلل البروتيني للبروتين الموسوم ب TAP ، SNU-71.

أدت تعديلات طريقة TAP إلى تقليل كمية تحلل البروتين بشكل كبير ، حيث تم حل جميع البروتينات ال 17 تقريبا في مركب U1 snRNP بواسطة SDS-PAGE وتم تحديدها بشكل إيجابي بواسطة قياس الطيف متعدد الكتلة. يظهر المجهر الإلكتروني للبقع السالب جزيئات أحادية التشتت من تنقية ناجحة بعد الخطوتين الأولى والثانية من TAP. في المقابل ، لا يتم ملاحظة أي جزيئات بالحجم الصحيح عندما يكون التنقية غير ناجح.

تم تقييم الجودة المعقدة النهائية على عشب من الجسيمات المنقاة ، كما هو موضح هنا ، والتي تظهر أحادية التشتت في الصورة الخام EM للبقعة السلبية. بالإضافة إلى ذلك ، تكشف متوسطات فئات الجسيمات عن ميزات مميزة تشير إلى أن العينة قد تكون مناسبة للدراسة الهيكلية. بمجرد إتقانه ، يمكن إكمال هذا البروتوكول في غضون 10 إلى 12 ساعة من إذابة مسحوق الخلية المجمدة.

أثناء اتباع هذا البروتوكول ، من المهم التأكد من أن جميع المحاليل خالية من البروتياز والنوكليازات ، وكذلك العمل بسرعة لمنع تجميع أو تفكك المجمع. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تفهم كيفية تنقية مجمع أصلي بجودة مناسبة للدراسة الهيكلية ، وكذلك كيفية تقييم تحقيق ذلك.