تنقية مجمعات الأصلية للدراسة الهيكلية باستخدام طريقة العلامة جنبا الى جنب الانجذاب

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تنقية معقد جزيئي ضخم أصلي بجودة مناسبة للدراسات الفيزيائية الحيوية. ولا يعمل هذا البروتوكول فقط كوسيلة لتنقية المعقد، بل كدليل مفصل لتقييم الجودة البنيوية للعينة أثناء عملية التنقية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول في أنه يتيح تنقية تجميع أصلي في ظروف محلول منظم قريبة من الظروف الفسيولوجية ببساطة وسرعة، وذلك لضمان التجانس التركيبي.

بعد طرد خلايا S.cerevisiae مركزياً، وتصريف السائل الطافي وفقاً للبروتوكول النصي، أضف 2 milliliters من محلول التحلل المبرد، ثم قم بتحريك الأنبوب و/أو استخدم ماصة سيرولوجية سعة 10 milliliter لإعادة تعليق الراسب. انقل معلق الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي من البولي بروبيلين سعة 50 milliliter فارغ ومحفوظ على الثلج. بعد ذلك، استخدم 2 milliliters إضافية من محلول التحلل المبرد لغسل كل زجاجة طرد مركزي وأضف المحلول إلى الأنبوب سعة 50 milliliter.

بعد تحديد الوزن الرطب لراسب الخلايا، يتم تحضير حمام من النيتروجين السائل داخل وحول أنبوب طرد مركزي مخروطي من مادة البولي بروبيلين سعة 50 milliliter. بعد ذلك، اسحب الخلايا العالقة في حقنة سعة five milliliter وقم بتوصيل إبرة مقاس 16 gauge بالحقنة. ثم، قم بتجميد معلق الخلايا عن طريق تمريره عبر الحقنة والإبرة في الحمام بمعدل تقريبًا one milliliter في الدقيقة لتوليد قطيرات.

لتحليل خلايا الخميرة، ابدأ باستخدام النيتروجين السائل لتبريد مطحنة القهوة مسبقاً. ثم أضف ما يصل إلى 40 grams من خلايا الخميرة واطحن لمدة 25 seconds، مع تكرار عملية الطحن ثماني أو تسع مرات. ويوصى بعدم إجراء التنقية لأكثر من 10 liters من المزرعة الخلوية في المرة الواحدة.

يقلل هذا من وقت التنقية ويضمن الحفاظ على السلامة الهيكلية للمعقد. بعد كل جولتين من الطحن، أضف طبقة رقيقة من النيتروجين السائل إلى المطحنة واتركها تتبخر. ولمنع تكتل الخلايا، تجنب ذوبانها عن طريق استخدام ملعقة مبردة بالنيتروجين السائل لتقليب الخلايا.

بعد عملية التحلل، يجب أن تظهر الخلايا على شكل مسحوق أبيض ناعم. بعد التحقق من تحلل الخلايا وتحضير محلول التحلل المنظم باستخدام PMSF و DTT ومثبطات البروتياز وفقاً للبروتوكول المكتوب، استخدم ملعقة مسطحة مبردة بالنيتروجين السائل لغرف مسحوق الخلايا المتحللة والمجمدة تدريجياً في أنابيب المحلول المنظم سعة 50 milliliter المحضرة. مع كل كمية مضافة، قم بتدوير أنابيب الـ 50 milliliter بلطف في درجة حرارة الغرفة لإذابة الخلايا وتذويبها ولمنع تكون الفقاعات.

مع ذوبان الخلايا، أضف المزيد من مسحوق الخلايا. بعد إضافة جميع الخلايا، استمر في إذابة وتذويب الخلايا حتى لا تُلاحظ أي تكتلات خلوية مجمدة في الأنابيب. يجب أن تستغرق هذه العملية حوالي 50 دقيقة.

بعد ذلك، قم بطرد محلول تحلل الخلايا مركزياً عند 25,000 ×g ودرجة حرارة 4 °C لمدة 20 دقيقة. وبمجرد تحلل الخلايا وعقب عملية الطرد المركزي، قد تلاحظ وجود طبقة داكنة صغيرة في الراسب غير القابل للذوبان. انقل السائل الطافي إلى أنابيب طرد مركزي فائقة من البولي كربونات وأضف 10 µL من 200 mM PMSF إلى كل أنبوب ممتلئ.

قم بطرد العينات مركزياً عند 100,000 ×g ودرجة حرارة 4 °C لمدة ساعة واحدة. في نهاية عملية الطرد المركزي، يجب أن تظهر أربع طبقات: راسب صلب شفاف يحتوي غالباً على معقدات ريبوسومية؛ راسب لين غني بالدهون؛ طبقة كبيرة شفافة مائلة للصفرة تحتوي على معظم البروتينات والمعقدات الذائبة في الخلية؛ وطبقة علوية قشرية تتكون من الدهون.

في غرفة باردة عند درجة حرارة 4 °C، استخدم ماصة سعة 1 مل لإزالة أكبر قدر ممكن من الطبقة الدهنية القشرية العلوية ثم تخلص منها. استخدم ماصة سيرولوجية سعة 10 مل لاستعادة معظم الطبقة الصفراء الشفافة. بعد ذلك، وباستخدام ماصة سعة 1 مل لتجنب تعكير الطبقتين السفليتين، استعد المليلترات القليلة المتبقية من هذه الطبقة.

من 40 جراماً من كتلة الخلايا الرطبة، يتم استعادة 48 مليلتر تقريباً من الطبقة الوسطى عادةً. وبعد تحضير IgG sepharose وفقاً للبروتوكول المكتوب، اخلط راتنج IGG مع الطافي من الطور الأوسط وقرصين صغيرين من مثبط البروتياز لكل 40 جراماً من الخلايا. ثم ضع المزيج على جهاز تدوير عند درجة حرارة أربعة درجات مئوية لمدة ساعتين.

هذا هو محلول IgG الدفعي. قم بتجهيز عمودين من نوع polyprep سعة 10 milliliter عن طريق قص نهايات الأعمدة لإنتاج فتحة مسطحة. صب 24 milliliters من ملاط راتنج IgG المعلق أو المحلول الدفعي في كل عمود، واتركه يترسب بفعل الجاذبية.

يعادل هذا 200 µL من راتنج IgG المعبأ. إذا استغرق الترسيب أكثر من 30 دقيقة، فقد تكون المرحلة الوسطى قد تلوثت بالدهون. عند اكتمال الترسيب، استخدم أربعة أحجام متتالية من محلول IgG D150 المنظم بحجم 10 mL لغسل العمود المعبأ.

لإجراء عملية القطع باستخدام بروتياز فيروس النقش التبغِي (TEV protease) على العمود، قم بسد الجزء السفلي من العمود وأضف 1 mL من منظم IgG D150 و 100 µL من بروتياز TEV. قم بسد الجزء العلوي من العمود، وباستخدام خلاط حراري بسرعة 750 RPM ودرجة حرارة 18 °C، اخلط لمدة 20 دقيقة. أعد تعليق الراتنج واخلط مرة أخرى لمدة 20 دقيقة.

بعد ذلك، قم بإعادة التعليق وتكرار عملية الخلط لمدة 20 دقيقة للمرة الثالثة. أعد العمود إلى درجة حرارة 4 °C واستخدم الجاذبية لاسترداد المعقد البروتيني. ثم أضف 200 µL من IgG D150 لاسترداد الحجم الميت.

بعد تحضير راتنج تقارب الكالمودولين (calmodulin affinity resin) وفقاً للبروتوكول المكتوب، أضف محلول ربط الكالمودولين والعينة إلى الراتنج، واستخدم جهاز تدوير الأنابيب للتحضين عند درجة حرارة 4 °C لمدة ساعة واحدة. قم بتحضير عمود PolyPrep بسعة 2 mL لكل 100 µL من ملاط الكالمودولين عن طريق قص نهاية العمود لعمل فتحة مسطحة. تفصل تفاصيل البروتوكول أحجاماً محددة للمحلول المنظم وفترة البقاء التي تم اختيارها للحفاظ على تركيز المعقد وتقليل وقت بقائه في الراتنج.

في حال تغيير حجم المزرعة، يُنصح بتغيير كمية الراتنج وحجم المحلول المنظم في أعمدة الجاذبية لمراعاة هذا التغيير. قم بتعبئة العمود بما لا يزيد عن 100 microliters من ملاط الكالمودولين (calmodulin slurry)، وباستخدام الجاذبية، استخدم 5 milliliters من محلول ربط الكالمودولين لغسل الراتنج ثلاث مرات. ثم قم بشطف البروتين ثلاث مرات باستخدام 200 microliters من محلول شطف الكالمودولين.

بعد ذلك، قم بسد الجزء السفلي من العمود وأضف 20 µL من محلول الاستخلاص (elution buffer) واتركه للحضن لمدة 2.5 دقيقة قبل إزالة السداد والسماح للبروتين بالاستخلاص بفعل الجاذبية. قم بسد الجزء السفلي من العمود مرة أخرى وأضف 200 µL من محلول الاستخلاص قبل الحضن لمدة خمس دقائق. ثم، قم بفك سداد الجزء السفلي من العمود واستخلص المحلول.

بالنسبة لعملية الشطف السادسة والنهائية، قم بسد قاعدة العمود وتحضينه مع محلول الشطف لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، قم بإزالة السداد وإجراء الشطف. قم بإجراء تحليل ما بعد التنقية وتخزين العينات وفقًا للبروتوكول المكتوب.

كما هو موضح هنا، أدت عملية تنقية أولية للمعقد باستخدام طريقة TAP وفقاً لبروتوكول منشور إلى الحصول على معقد ظهر على شكل ثلاث حزم في هلام مصبوغ بالفضة. وقد أدت جولات متعددة من تحسين طريقة TAP إلى الحصول على معقد ظهر كحزمة واحدة في هلام أصلي (native gel)، مما يشير إلى تجميع أكثر تجانساً. وتماشياً مع نتيجة الهلام الأصلي، كشف تحليل اللطخة الغربية (western blotting) باستخدام جسم مضاد لـ TAP ضد المعقد، الذي تم تنقيته وفقاً للبروتوكول المنشور، عن حدوث تحلل بروتيني للبروتين الموسوم بـ TAP، وهو SNU-71.

أدت التعديلات التي أُجريت على طريقة TAP إلى تقليل كمية التحلل البروتيني بشكل كبير، حيث تم فصل جميع البروتينات الـ 17 الموجودة في معقد U1 snRNP تقريبًا بواسطة SDS-PAGE وتم التعرف عليها إيجابيًا باستخدام مطياف الكتلة المتعدد. ويظهر المجهر الإلكتروني بالصبغة السلبية جسيمات أحادية التشتت ناتجة عن عملية تنقية ناجحة بعد الخطوتين الأولى والثانية من TAP. وفي المقابل، لا يمكن ملاحظة أي جسيمات بالحجم الصحيح عندما تفشل عملية التنقية.

تم تقييم جودة المعقد النهائي على مساحة من الجسيمات المنقاة، الموضحة هنا، والتي تظهر موزعة بشكل أحادي في الصورة الخام للمجهر الإلكتروني (EM) باستخدام الصبغ السلبي. بالإضافة إلى ذلك، تكشف متوسطات الفئات للجسيمات عن سمات مميزة تشير إلى أن العينة قد تكون مناسبة للدراسة البنيوية. وبمجرد إتقان هذا البروتوكول، يمكن إكماله في غضون 10 إلى 12 ساعة من إذابة مسحوق الخلايا المتحللة المجمد.

أثناء اتباع هذا البروتوكول، من المهم التأكد من خلو جميع المحاليل من البروتياز والنوكلياز، بالإضافة إلى العمل بسرعة لمنع تجمع أو تفكك المعقد. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون قد استوعبت كيفية تنقية معقد أصلي بجودة مناسبة للدراسة التركيبية، وكيفية تقييم تحقيق ذلك.