عزل مجمعات RNA والبروتينات وما شابه ذلك من الخلايا عن طريق شطف موجهة قليل النوكليوتيد-
يناير 16, 2017
تصف هذه المخطوطة نهجا لعزل RNPs المماثلة المختارة المتكونة في الخلايا حقيقية النواة عبر تخصيب محدد موجه بقليل النوكليوتيدات. نوضح قابلية تطبيق هذا النهج من خلال عزل RNP المماثل المرتبط بالمنطقة غير المترجمة 5 بوصات التي تتكون من DHX9 / RNA helicase A.
الهدف العام من تقنية الترسيب المناعي للحمض النووي الريبي هو عزل وتوصيف مجمعات بروتين الحمض النووي الريبي الذاتية التي تتشكل في الخلايا حقيقية النواة بشكل انتقائي عبر تخصيب موجه بقليل النوكليوتيدات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التحكم بعد النسخ ، مثل تكوين بروتينات ربط الحمض النووي الريبي التي تحدد UTR الخمسة الأولية لنسخة الفيروسات القهقرية لتنظيم تعبيرها الجيني. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح للباحث بعزل وتوصيف مركب بروتين RNA معين ذي أهمية بشكل انتقائي مع الحفاظ على إمكانية إجراء تحليل أكثر شمولا ل RNP في اتجاه مجرى النهر.
حسنا ، تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو الفهم الأساسي للالتهابات الفيروسية والعديد من الأمراض الخلوية. ويوفر نظرة ثاقبة حول آليات التحكم بعد النسخ في التعبير الجيني. قد يعني ذلك أهدافا جديدة للمخدرات قابلة للتطبيق.
بعد زراعة الخلايا وإجراء الترسيب المناعي لبروتين موسوم ب FLAG وفقا لبروتوكول النص ، انقل 60 ميكرولترا لكل IP من ملاط الخرزة المغناطيسية pro-TG إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.7 مل. ضع الأنبوب على رف مغناطيسي وقم بإزالة محلول التخزين عن طريق سحب العينة بعناية. ثم قم بإزالة الأنبوب من الرف.
أضف 600 ميكرولتر من 1x المخزن المؤقت للغسيل. ووضع الأنبوب على طرف دوار في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق ، لغسل الخرزات وتوازنها. ضع الأنبوب على الرف المغناطيسي وقم بإزالة مخزن الغسيل.
ثم أضف 10 أحجام من مخزن الغسيل الطازج 1x. أضف الجسم المضاد FLAG المرسب المناعي إلى الخرز المغناطيسي المؤيد ل TG المتوازن. ثم قم بتدوير الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل ، لاقتران الجسم المضاد المرسب المناعي.
ضع الأنبوب على المغناطيس وقم بإزالة المادة الطافية. ثم قم بإزالة الأنبوب من المغناطيس وأضف 1x مخزن مؤقت للغسيل إلى الخرز وقم بتدويره في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق. كرر خطوة الغسيل مرتين وقم بإزالة المخزن المؤقت النهائي.
قم بإزالة وسط الثقافة من الخلايا عن طريق الشفط واستخدم 1.5 مل من PBS المثلج لغسل الخلايا مرتين. باستخدام مكشطة الخلية ، قم بإزاحة الخلايا الرطبة الملتصقة. قم بتعليق الخلية في أنابيب جديدة ثم قم بالطرد المركزي للثقافة عند 226 مرة جم في أربع درجات مئوية ، لمدة أربع دقائق.
أضف 375 ميكرولتر من المحلول المؤقتة منخفضة الملح المثلج إلى حبيبات الخلية ، واحتضن العينة على الجليد لمدة خمس دقائق للسماح بالتورم. من المهم توخي الحذر عند إضافة وإعادة تعليق حبيبات الخلية في المخزن المؤقت لتحلل الملح المنخفض, لضمان الغمر الكامل والتورم دون تعطيل ميكانيكي سابق لأوانه. لجمع محللة الخلية السيتوبلازمية ، أضف 125 ميكرولترا من محلول تحلل الجليد البارد ، ثم استخدم الخالط Dounce المبرد مسبقا لأداء عشر ضربات.
قم بتجانس التخليص بقوة كافية لتمكين تحلل غشاء البلازما وملوثات المحللة السيتوبلازمية التي تم إطلاقها. لكن احرص على عدم الإفراط في التعطيل الميكانيكي والمخاطرة بالتلوث النووي أو تعطيل مركب بروتين الحمض النووي الريبي أو فقدان الدوران المتجانس الذي تم إطلاقه في ميكروفوجوج بأقصى سرعة لمدة دقيقة واحدة. ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 1.7 مليلتر كان على الجليد.
تحديد إجمالي تركيز البروتين. احتفظ بنسبة 10٪ لتحليل اللطخة الغربية ، لاستخدامها كعنصر تحكم في المدخلات. لإجراء الترسيب المناعي ، أضف الحجم المطلوب من محللة الخلايا المحصودة إلى الخرز المترافق بالأجسام المضادة المستهدفة.
باستخدام مخزن مؤقت للغسيل 1x ، ارفع الحجم الإجمالي إلى 600 ميكرولتر وقم بتدوير العينة في درجة حرارة الغرفة. بعد 90 دقيقة من الحضانة ، ضع أنبوب IP على رف المغناطيس لجمع الخرز. ثم اجمع المادة الطافية واحتفظ بها أثناء التدفق.
بعد ذلك ، أضف 10 أحجام من المخزن المؤقت للغسيل المثلج البارد NETN 150 إلى حبات الأجسام المضادة المرتبطة ب RNP ، وقم بتدوير العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق. بعد إعادة تعليق مجمعات RNP المجمدة في مخزن مؤقت ملزم 1x وفقا لبروتوكول النص ، اضبط الحجم المتبقي في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت المرتبط البارد 1x. وقم بتسخين الأنبوب على حرارة 70 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق.
لعزل مجمعات بروتين الحمض النووي الريبي المماثلة ، أضف ما يقرب من 30 نيوكليوتيدات من الحمض النووي oligo ، مكملة لحدود التسلسل الأولية الثلاثة للحمض النووي الريبي المعني. واحتضنها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع هزاز لطيف. أضف خمس إلى عشر وحدات أو RNase H إلى الأنبوب واحتضان العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة لشق الحمض النووي الريبي من هجين الحمض النووي الريبي.
ثم انقل المادة الطافية التي تحتوي على مجمعات RNP الملتقطة ذات الأهمية إلى أنبوب معقم من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.7 ملليلتر. لجمع الحمض النووي الريبي المرسب المناعي ، أعد تعليق نصف العينة الإجمالية لمجمعات الحمض النووي الريبي التي تم التقاطها في 750 ميكرولتر من كاشف ثيوسيانات غوانيدينيوم الحمضي. أضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى الأنبوب ، ورجها بقوة لمدة 10 ثوان ، واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق.
بعد الطرد المركزي ، اجمع المرحلة المائية في أنبوب جديد ، وأضف كمية متساوية من الأيزوبروبانول. تخلط جيدا وتحتضن العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة عشر دقائق على الأقل. أضف ميكرولتر واحد من الجليكول الأزرق إلى العينة وقم بتخزينها عند سالب 20 درجة مئوية من أجل هطول الأمطار أو المعالجة الفعالة في تاريخ مستقبلي.
الطرد المركزي الأنبوب عند 16،000 مرة G في أربع درجات مئوية لمدة عشر دقائق. استخدم ماصة دقيقة P200 لجمع المادة الطافية والتخلص منها بعناية حتى لا تزعج حبيبات الحمض النووي الريبي. أضف 500 ميكرولتر من 75٪ إيثانول إلى كل أنبوب.
دوامة وأجهزة الطرد المركزي الأنابيب لمدة خمس دقائق. اجمع المادة الطافية بعناية وتخلص منها كما هو موضح للتو. جفف الحبيبات بالهواء لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق واستخدم 100 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase لإعادة تعليقها.
ضع 100 ميكرولتر من عينة الحمض النووي الريبي على عمود تنظيف الحمض النووي الريبي. ومعالجتها وفقا لبروتوكول الشركات المصنعة. أخيرا ، قم بتصفية الحمض النووي الريبي في 30 ميكرولترا من الماء الخالي من RNase وقم بتخزينه عند سالب 80 درجة مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر.
لعزل عناصر التحكم بعد النسخ ، أو مجمعات البروتين النووي الريبي PCE ، GAG ، RNA ، RHA التي تشكلت في الخلايا المتكاثرة. تم إجراء الترسيب المناعي FLAG-MS2 RNP في محللات الخلايا HECK293 المنقولة. تظهر النتائج هطول الأمطار الفعال لبروتين FLAG-MS2.
حيث تم العثور على DHX9 / RHA في مركب RNP وليس ضمن التحكم في نظائر IgG ، ولا ضمن التحكم السلبي. تظهر هنا بقع غربية من مجمعات الحمض النووي الريبي المهضومة RNase H. شق RNase H PCE GAG RNA ، مما أدى إلى إطلاق مركب RNP المرتبط على وجه التحديد ب UTR الخمسة الأولية.
تم إثراء RNPs المرتبطة ب DHX9 / RHA في المواد المزلئة. الأهم من ذلك ، ظلت RNPs المرتبطة ب FLAG-MS2 مع الخرز المترافق بالأجسام المضادة. في هذه التجربة ، تم التحقق من صحة الترسيب المناعي HO للحلقة الجذعية MS2 ، التي تحتوي على الفيروسات القهقرية PCE GAG RNA في الخلايا وفي المواد المزيئة ، بواسطة RT-PCR و QRT-PCR.
أكدت النتائج وجود ارتباط محدد بين DHX9 / RHA و UTR الخمسة رئيسي للفيروسات القهقرية ، والذي تم تسليط الضوء عليه على أنه RNP فريد ، مهم للتحكم في الترجمة المستهدفة. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون خمس ساعات تقريبا ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تنفيذ جميع الخطوات بكفاءة وعناية ، لضمان الحفاظ على مجمعات RNP السليمة وعزل مجمع RNP المحدد ذي الأهمية.
باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل قياس الطيف الكتلي و RNA-Seq ، من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل ارتباط البروتين العالمي بالحمض النووي الريبي المستهدف. والمنطقة أو التحليل الكامل لجميع النصوص المشاركة في RNP معين. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحث في مجال التحكم الجيني بعد النسخ لاستكشاف مجمعات بروتين الحمض النووي الريبي المتميزة التي تحكم انتهاء صلاحية الجينات الفيروسية المسببة للأمراض والآلية العامة للتحكم في التعبير الجيني الخلوي.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية حصاد مجمعات RNP الخلوية السليمة وتحديد تكوينها باستخدام التخصيب الانتقائي الموجه بقليل النوكليوتيدات. لا تنس أيضا أن العمل مع الفيروسات المسببة للأمراض والعينات البيولوجية والمواد الكيميائية الخطرة مثل الحمض أو الفينول ، يمكن أن يكون خطيرا للغاية. يجب دائما اتخاذ جميع الاحتياطات ، مثل معدات الحماية الشخصية المناسبة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تصف هذه المخطوطة تقنية ترسيب المناعة للحمض النووي الريبي لعزلة وتوصيف معقدات الحمض النووي الريبي والبروتين الذاتية بشكل انتقائي في الخلايا حقيقية النواة. تركز الطريقة على المنطقة غير المترجمة 5' الفيروسية العكوسة وتسلط الضوء على دور DHX9/الهليكازة النووية الرسولية A.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا الحمض النووي الريبي
- التحكم بعد النسخ
- التعبير الجيني الفيروسي
الخلفية
- تلعب معقدات الحمض النووي الريبي والبروتين أدوارًا حاسمة في تنظيم الجينات.
- فهم هذه المعقدات يمكن أن يوفر رؤى حول الالتهابات الفيروسية.
- التحكم بعد النسخ حيوي لتنظيم التعبير الجيني.
- المنطقة غير المترجمة 5' مهمة في النصوص الفيروسية العكوسة.
هدف الدراسة
- لعزل معقدات معينة للحمض النووي الريبي والبروتين باستخدام التخصيب الموجه بالأوليجونوكليوتيد.
- لتوصيف تكوين البروتينات الرابطة للحمض النووي الريبي في النصوص الفيروسية العكوسة.
- لاستكشاف الآثار المترتبة على الالتهابات الفيروسية والأمراض الخلوية.
الطرق المستخدمة
- تقنية ترسيب المناعة للحمض النووي الريبي.
- التخصيب الموجه بالأوليجونوكليوتيد.
- توصيف البروتينات الرابطة للحمض النووي الريبي.
- تحليل تفاعلات الحمض النووي الريبي والبروتين.
النتائج الرئيسية
- العزل الناجح لمعقدات الحمض النووي الريبي والبروتين الملازمة النصوص الفيروسية العكوسة.
- التعرف على DHX9/الهليكازة النووية الرسولية A في المعقدات المعزولة.
- رؤى حول آليات التحكم بعد النسخ.
- تحديد محتمل للأهداف الدوائية الجديدة للالتهابات الفيروسية.
الاستنتاجات
- تعزز التقنية فهم تفاعلات الحمض النووي الريبي والبروتين.
- توفر إطارًا لدراسة التنظيم بعد النسخ.
- قد تؤدي النتائج إلى استراتيجيات علاجية جديدة ضد الأمراض الفيروسية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This method enables selective isolation of specific RNA-protein complexes from eukaryotic cells, supporting target validation in post-transcriptional gene regulation. By enriching cognate RNPs at the 5' UTR of retroviral transcripts, it provides mechanistic insights into viral translation control and cellular stress response pathways. The approach aids in de-risking target hypotheses by defining RNP composition relevant to antiviral and disease-modifying strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by defining RNA binding protein composition at specific RNA elements.
- Operational Value: Supports biological de-risking through functional validation of RNA-protein interactions in disease-relevant contexts.
- Predictive Value: Enhances confidence in target selection by linking RNP complexes to translational control of viral and stress-response genes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated RNP complexes for downstream proteomic and biochemical analysis.
- Operational Value: Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for assay standardization and screening readiness.
- Platform Value: Enables scalable isolation of cognate complexes for reliable compound evaluation in follow-up workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports translational continuity by linking discovery-phase RNP identification to preclinical validation of gene regulation mechanisms.
- Operational Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions through mechanistic de-risking of post-transcriptional targets.
- Predictive Value: Aligns with biomarker development by identifying RNP components associated with pathogenic gene expression.
Pipeline & Workflow Integration
The technique fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, particularly for RNA-mediated mechanisms of gene expression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating specific RNP complexes from cellular lysates.
- Screening: Enables assay readiness through standardized isolation of RNA-protein complexes with defined composition.
- Analytics: Generates protein and RNA readouts that allow comparative analysis of RNP composition under varying conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing mechanistic insight into viral and cellular gene expression control.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for probing RNA-protein interactions across multiple targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in RNA-regulated pathways.
- Operational Value: Promotes standardization and reproducibility in RNP isolation across laboratories and projects.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early de-risking of targets involved in post-transcriptional control.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of antiviral and cellular stress-response programs based on RNP composition data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, immunoprecipitation, and RNA handling techniques.
- Depends on access to magnetic bead systems, centrifuges, and RNase-free laboratory equipment.
- Necessitates cross-team standardization of oligonucleotide design and RNase H digestion protocols.
- Involves adaptation considerations when applying to different RNA targets or cell types.
- Includes practical limitations such as the need for careful handling to preserve RNP integrity during lysis and elution steps.
