تقارب كشف وسمها الذاتية المستقبلات من الزرد الأجنة

الهدف العام من هذا الإجراء هو الكشف عن مستقبلات عامل النمو منخفض الوفرة في أجنة أسماك الزرد من خلال الجمع بين انتقائية وحساسية تسمية التقارب للمستقبل المختار بواسطة الترابط المشع. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة في مجالات علم الأحياء التنموية مثل مستويات التعبير عن المستقبلات وخصائصها الكيميائية الحيوية. هذه الطريقة التي أطلقنا عليها اسم AFLIP توسع صفات وصفية قوية لوضع العلامات على التقارب ، وهي تقنية بيولوجيا الخلية الراسخة للدراسات التنموية لسمك الزرد.

لبدء هذا الإجراء ، اجمع 100 إلى 200 جنين لكل حالة وضعها في أطباق بتري تحتوي على ماء السمك. ثم قم بفك الأجنة يدويا باستخدام ملقط رفيع الرؤوس وتجنب استخدام البروناز أو أي بروتياز آخر في جميع أنحاء البروتوكول لأنه قد يهضم المستقبلات المستهدفة. بعد ذلك ، ضع الأجنة في أنبوب ميكروفوج سعة 1.5 ملليلتر واغسلها مرتين باستخدام 1X PBS.

ثم أضف 500 ميكرولتر من عازلة إزالة الصفار حرر معظم صفار البيض عن طريق سحب الأجنة في المحلول برفق لأعلى ولأسفل حوالي 30 إلى 40 مرة. بالنسبة ل 72 أجنة HPF و 48 HPF ، استخدم أطراف ماصة زرقاء وصفراء على التوالي.

قد تحتاج الأطراف الصفراء إلى القطع قليلا لتجنب تدمير الأجنة. يمكن التحقق من إطلاق صفار البيض الناجح من خلال مراقبة الأجنة تحت المجهر. يجب أن تكون إزالة صفار البيض كاملة قدر الإمكان حيث قد تتداخل الدهون والبروتينات في صفار البيض مع خطوات ربط الترابط أو الأجسام المضادة اللاحقة.

بعد ذلك ، اجمع الأجنة عن طريق الطرد المركزي عند 600 × جم لمدة 15 ثانية. تخلص من المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة. بعد ذلك ، اغسل الأجنة مرتين باستخدام 500 ميكرولتر من محلول الغسيل عن طريق تدويرها برفق بأقل سرعة.

ثم اجمع الأجنة عن طريق الطرد المركزي عند 600 × جم لمدة 15 ثانية. من الآن فصاعدا ، استمر في الإجراء عند أربع درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة.

بعد ذلك ، نقوم بتعليق الأجنة في 350 ميكرولتر من محلول التحلل وتجانسها باستخدام مدقة بلاستيكية. ثم احتضان الأجنة المحللة لمدة 30 دقيقة مع التحريض على هزاز أنبوب اختبار عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للأجنة المحللة عند 11 ، 000 × جم لمدة 15 دقيقة لإزالة الحطام غير القابل للذوبان.

بعد ذلك ، انقل المادة المطفية التي تم تطهيرها إلى أنبوب جديد. حدد البروتين الكلي بواسطة مقايسة بروتين برادفورد ومنحنى معايرة المؤامرة. في هذه الخطوة ، ضع 400 إلى 500 ميكروغرام من بروتين الجنين الكلي في أنبوب ميكرو فوج سعة 1.5 مليلتر وقم بتخفيفه إلى ميكروغرام واحد لكل ميكرولتر مع المخزن المؤقت 1.

بعد ذلك ، أضف مخزون ملصق اليود 125 TGF-beta II للوصول إلى التركيز النهائي البالغ 150 بيكومولار واحتضانه مع التحريك على هزاز أنبوب اختبار لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، أضف الجسم المضاد غير المخفف ضد المستقبل محل الاهتمام من أجل الوصول إلى تخفيف 1: 100. ثم استمر في الحضانة عند أربع درجات مئوية لمدة ساعتين أخريين أو طوال الليل.

بعد الحضانة ، أضف 50 ميكرولترا من حبات ربط الغلوبولين المناعي المناسبة واحتضنها لمدة 50 دقيقة مع التحريض على هزاز أنبوب اختبار عند أربع درجات مئوية. ثم استرجع الخرزات عن طريق الطرد المركزي الدقيق عند 11 ، 000 × جم لمدة 20 ثانية وتخلص من المادة الطافية في حاوية قمامة مشعة مناسبة. بعد ذلك ، اغسل حبات IP ثلاث مرات باستخدام مليلتر واحد من المخزن المؤقت للغسيل IP عن طريق الدوامة عند الطرد المركزي الدقيق عند 11 ، 000 × جم لمدة 20 ثانية في كل مرة.

ثم قم بتعليق حبات IP في 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت لغسيل IP. قم بإعداد محلول DSS الطازج وأضف 1.5 ميكرولتر منه إلى العينة. بعد ذلك ، احتضان العينة لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية مع التحريض.

من أجل إخماد تفاعل الربط المتقاطع ، أضف 500 ميكرولتر من محلول الغسيل IP المكمل بمخزون كلوريد المحاولة الكافي عند درجة الحموضة 7.4 للوصول إلى 25 مللي مولار كلوريد التريست. بعد ذلك ، جهاز الطرد المركزي عند 11 ، 00 × جم لمدة 20 ثانية لجمع حبات IP. بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبات IP في 30 ميكرولتر من تقليل المخزن المؤقت laemmli.

بعد ذلك ، قم بغلي العينة عند 94 درجة مئوية لمدة خمس دقائق قبل الرحلان الكهربائي للهلام SDS-PAGE ثم قم بتحليل المواد الهلامية المجففة في مقياس الفوسفور أو عن طريق التصوير الشعاعي الذاتي التقليدي. يوضح هذا الشكل النتائج التمثيلية التي تم الحصول عليها باستخدام AFLIP. خضع إجمالي البروتين المستخرج من الأجنة عند 72 hpf و 48 hpf لوضع العلامات على تقارب اليود -125 TGF-beta II متبوعا ب IP مع الأرانب المضادة لسمك الزرد BG أو الأرانب المضادة للفئران BG كعنصر تحكم.

في التصوير الشعاعي الذاتي ، يمكن اكتشاف BG بدون GAG أو على شكل BG معدل بالجليكوزامينوجليكان. يوضح هذا الشكل كيف يمكن استخدام AFLIP لقياس مستويات التعبير عن مستقبل معين في الأجنة المعرضة للتلاعب التجريبي ، في هذه الحالة ، انخفاض البيتاجليكان إلى حقن المورفولينو. يظهر الممر الأول مستوى مستقبلات بيتا TGF III في جنين من النوع البري 72 حصانا ، بينما يظهر الممر الثاني تأثير إعطاء سبعة نانوغرامات من مورفولينو موجه إلى حدود exon 2-intron 2 لنسخة ZFPG الأساسية. لاحظ أن تنظيم BG الذي تم الحصول عليه باستخدام هذا الموفولينو لا يتم استنساخه من خلال سيطرته غير المتطابقة.

أكدت هذه النتائج أن النمط الظاهري الذي تم الحصول عليه باستخدام هذا الموفولينو كان خاصا بالضربة القاضية لمستقبلات بيتا TGF III كما هو موضح من قبل. يعتمد نجاح AFLIP في الكشف عن عامل النمو أو مستقبلات السيتوكين على توافر رابط ذو علامات إشعاعية يمكن ربطه وربطه بمستقبله. يتطلب أيضا وجود جسم مضاد جيد للترسيب المناعي.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون يومين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. نظرا لأن AFLIP يتجنب خطوة نقل اللطخة الغربية ، فإنه يسمح باكتشاف محسن للمستقبلات شديدة الغليكوزيلات. وقد رأينا هنا بالنسبة للبيتا جليكان البروتيوغليكان الذي ينتقل بشكل غير فعال للغاية في اللطخة الغربية بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الهضم الأنزيمي من أجل وصف تعديل إضافي بعد الترجمة طالما تم الكشف عنها بواسطة تقنيات الكهرباء.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية مساعدة AFLIP في اكتشاف المستقبلات الوفيرة المنخفضة في العديد من أجنة الأسماك عن طريق وضع العلامات على التقارب المرتبط بالترسيب المناعي. أخيرا ، لا تنس أن العمل مع اليود 125 يجب أن يتم بعناية وحماية كافية. حظا سعيدا في تجاربك.