إعداد العينات MALDI متجانسة للتطبيقات الكمية

الهدف العام من طريقة تحضير العينات هذه المخصصة لتقنية MALDI MS هو تقليل التباين المكاني في إشارات الأيونات أثناء تحليل MALDI MS. وقد تم إنشاء بيئة تجفيف محكومة بدقة لتحسين طريقة القطرة المجففة التقليدية، وذلك عن طريق التحكم في التدفقات الهيدروديناميكية داخل قطرة العينة أثناء عملية التجفيف. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية تقليل التباين المكاني لإشارات الأيونات في العينات المحضرة بطريقة القطرة المجففة المحسنة بشكل فعال. كما يمكن لهذه الطريقة توفير عينات متجانسة لنظام قياس THAP.

كما يمكن تطبيق ذلك على أنظمة قياس أخرى، مثل حمض ألفا-سيانو-4-هيدروكسي سيناميك (alpha-Cyano-4-hydroxycinnamic acid). وبوجه عام، يواجه الأفراد المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة لأن التحكم في ظروف التجفيف ليس بالأمر السهل. لبدء هذا الإجراء، افتح باب غرفة التجفيف وضع فوراً صفيحة عينات تم تنظيفها مسبقاً على الكتلة القائمة على النحاس.

بعد ذلك، أغلق الباب. قم بضبط مقياس تدفق الغاز يدويًا لضبط معدل تدفق النيتروجين على 10 standard cubic feet per hour. بعد ذلك، قم بضبط مقياس تدفق الغاز بدقة لضمان بقاء الرطوبة النسبية دائمًا أقل من 25% في غرفة التجفيف، وفقًا لقياس مقياس الرطوبة.

باستخدام المزدوجات الحرارية من النوع K لمراقبة درجة الحرارة، اضبط درجة حرارة جهاز تدوير المياه يدويًا حتى تصل صفيحة العينات إلى 5 degrees Celsius لبدء التجربة. تأكد من الوصول إلى درجات الحرارة المطلوبة والرطوبة النسبية المحددة قبل ترسيب العينة. اخلط 0.25 µL من محلول THAP بتركيز 0.1 M و 0.25 µL من المادة التحليلية المطلوبة في أنبوب طرد مركزي دقيق.

قم برج sample بواسطة جهاز الـ vortex لمدة ثلاث ثوانٍ. بعد ذلك، قم بإجراء عملية الطرد المركزي للـ sample لمدة ثانيتين لتجميع المحلول في قاع أنبوب الطرد المركزي الدقيق. بعد الطرد المركزي، افتح باب غرفة التجفيف وضع بعناية 0.1 µL من المحلول على لوحة العينات باستخدام الماصة.

أغلق الباب على الفور وانتظر حتى تجف قطرة العينة. فعندما تكون درجة حرارة لوحة العينة أقل من درجة حرارة المحيط، تزداد السرعة المتوسطة لتدفقات إعادة التدوير داخل القطرة بشكل ملحوظ لإعادة توزيع الجزيئات. ويعد ترسيب العينة الخطوة الأكثر أهمية التي تحدد جودة البيانات وقابلية تكرار النتائج.

يجب ترسيب محلول العينة المخلوط مسبقاً فوراً على صفيحة العينة لضمان تبلور العينة تحت ظروف خاضعة للتحكم. بعد التجفيف، افتح باب غرفة التجفيف.

بعد ذلك، اضبط درجة حرارة جهاز تدوير المياه على 25 °C. وبمجرد عودة درجة حرارة لوحة العينات إلى 25 °C، قم بإخراج لوحة العينات من غرفة التجفيف. افحص شكل العينات تحت مجهر ستيريو (Stereo microscope) بتكبير قدره خمس مرات، والتقط صورة مجهرية بنظام المجال المضيء (brightfield image).

في هذه المرحلة، أدخل لوحة العينة في مطياف كتلة MALDI. ثم، قم بإجراء تحليل التصوير بمطياف الكتلة. اختر ذروة كتلة مميزة من قائمة الكتل المعروضة في نافذة النتائج وانقر فوق 2D لرسم صورة أيونية ثنائية الأبعاد.

بعد ذلك، انقر فوق أزرار الضبط في النافذة المنبثقة لتحديد الحدود العليا والسفلى لشدة الإشارة، ولزيادة دقة الصورة، ثم انقر فوق حفظ الصورة. لاحظ وقارن صورة الأيونات مع صورة المجال المضيء التي تم الحصول عليها مسبقاً لتحديد منطقة العينة الأساسية. الآن، انقر فوق النقاط الفارغة والمناطق المتشققة في صورة الأيونات المعروضة في نافذة النتائج لضبط المنطقة المراد تحليلها بدقة.

انقر فوق زر "Find edge" (البحث عن الحافة) لتحديد الطبقة الخارجية من صورة الأيونات. بعد ذلك، انقر فوق "Deduct" (خصم) لحفظ معلومات وفرة الأيونات للطبقة الخارجية في قاعدة بيانات، وإزالة هذه الطبقة من صورة الأيونات في آن واحد. بعد تكرار الخطوات السابقة حتى يتم تحديد مركز صورة الأيونات، انقر وحدد جميع مربعات الاختيار في قائمة بيانات المخرجات، ثم انقر فوق "Export" (تصدير) لتصدير البيانات.

أخيرًا، افتح البيانات المصدرة باستخدام برنامج جداول بيانات لحساب متوسط وفرة الأيونات في كل طبقة، وذلك للحصول على معلومات التوزيع المكاني للأيونات. في صور المجال المضيء وصور MALDI للمالتوتريوز، يتركز إشارة الأيون للشكل المضاف إليه الصوديوم بشكل أساسي عند محيط منطقة العينة، عندما يتم تحضيرها بدرجة حرارة لصفيحة العينة تبلغ 25 درجة مئوية. ومن خلال خفض درجة الحرارة إلى 5 درجات مئوية، تتوزع الإشارة بشكل متجانس عبر كامل منطقة العينة، مما يشير إلى أن تحضير العينات تحت درجة حرارة أقل لصفيحة العينة يمكن أن يعيد توزيع الجزيئات بشكل كبير ويقلل من عدم التجانس.

تُظهر صورة أيون قطعة البراديكينين المبرتنة اتجاهاً مشابهاً للمالتوتريوز المصبن. وتُبين التحليلات الإحصائية أن عدم تجانس إشارات الأيونات التي تم الحصول عليها عند درجة حرارة لصفيحة العينة تبلغ 5 degrees Celsius ينخفض بنسبة 60 إلى 80 بالمائة، مقارنة بتلك التي تم الحصول عليها عند 25 degrees Celsius. وفي حالة المالتوتريوز المصبن، وعندما تكون درجة حرارة صفيحة العينة 25 degrees Celsius، تكون شدة الإشارات في المراكز أقل بكثير من تلك التي تكون عند درجة حرارة 5 degrees Celsius.

يظهر جزء البراديكينين المبرتنة تفاوتاً أقل عند خفض درجة حرارة لوحة العينة من 25 إلى 5 درجات مئوية. وأثناء محاولة تطبيق طريقة التجفيف هذه، يجب التحكم بدقة في درجات الحرارة والرطوبة النسبية داخل غرفة التجفيف ومراقبتها. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تحضير العينة في غضون 30 دقيقة إذا نُفذت العملية بشكل صحيح.

بعد تطويرها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال MALDI MS لاستكشاف التحليل الكمي لعينات القطيرات المجففة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير عينات قطيرات مجففة متجانسة لتحليل MALDI MS.