تطوير التهاب القولون نموذج مدفوعة مستضد لدراسة عرض المستضدات التي كتبها مستضد الخلايا إلى خلايا T

يتمثل الهدف العام من نموذج التهاب القولون المدفوع بالمستضد هذا في تحديد ما إذا كانت الخلايا البلعمية أحادية النواة الموجبة لـ CX3 وCR1 تتفاعل مع الخلايا التائية الموجبة لـ CD4 وتنشطها أثناء التهاب القولون النوعي للمستضد، وما إذا كان توسع الخلايا التائية المؤثرة المعتمد على الخلايا البلعمية أحادية النواة يحدث داخل الصفيحة المخصوصة المعوية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال أمراض الأمعاء الالتهابية، مثل أنواع التفاعلات التي تحدث بين الخلايا المقدمة للمستضد والخلايا التائية المؤثرة في الصفيحة المخصوصة للقولون. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تتيح دراسة التفاعل بين الخلايا المناعية والعناصر التي تؤدي إلى إمراضية أمراض الأمعاء الالتهابية.

تستخدم هذه الطريقة نموذج التهاب القولون الناتج عن نقل الخلايا التائية، حيث يتم نقل خلايا T CD4 الساذجة النوعية للمستضد والموسومة بالفلورية الحمراء إلى مضيف يعاني من نقص المناعة ويعبر عن البروتين الفلوري الأخضر في الخلايا أحادية النواة. يلي نقل الخلايا إعطاء بكتيريا تعبر عن المستضد وموسومة بالفلورية الزرقاء عن طريق التغذية القسرية الفموية. ويمكن مراقبة الأحداث المناعية التي تحدث في الصفيحة المخصوصة المعوية للمضيفين في مراحل مختلفة من تطور المرض.

استخدم مقص التشريح لفتح القولون طولياً واغسل النسيج في طبق بتري يحتوي على 25 milliliters من PBS لإزالة أي بقايا ومخاط. قطع القولون إلى قطع يتراوح طولها بين خمسة إلى ثمانية مليمتر، وضع الشظايا الناتجة في 20 milliliters من DPBS طازج خالٍ من الكالسيوم والمغنيسيوم، ومُدعم بـ ten millimolar HEPES و five millimolar EDTA. استخدم جهاز الرج (Vortex) للأنبوب الذي يحتوي على العينة لمدة 30 ثانية على أقصى سرعة.

بعد ذلك، يتم التحضين عند 37 درجة مئوية لمدة عشر دقائق مع الرج الخفيف لإزالة الظهارة. وفي نهاية التحضين، يُستخدم جهاز Vortex مرة أخرى لمدة 30 ثانية. ثم يتم التخلص من الطافي الذي يحتوي على الخلايا الظهارية.

انقل قطع النسيج إلى أنبوب جديد يحتوي على 20 milliliters من منظم PBS و HEPES و EDTA الطازج، وكرر عملية التحضين مع خطوات الرج باستخدام جهاز الفورتكس قبل وبعد ذلك. بعد التكرار الثالث، يتم إزالة جميع الخلايا الطلائية ويصبح السائل الطافي رائقاً. اغسل شظايا النسيج برفق في PBS لإزالة أي خلايا طلائية متبقية.

قطع شظايا الأنسجة إلى قطع بحجم 2×2 مليمتر، وانقل القطع للهضم في 10 مليمتر من وسط RPI، المكمل بـ 0.5 مليجرام/مليلتر من collagenase type eight و 10 وحدات/مليلتر من DNAse one. رج العينات باستخدام جهاز Vortex لمدة 30 ثانية. بعد ذلك، حضن قطع الأنسجة عند 37 درجة مئوية مع الرج لمدة تتراوح من 30 إلى 35 دقيقة، مع رج الأنبوب بجهاز Vortex كل خمس دقائق أثناء فترة التحضين.

عندما يتم هضم النسيج، قم بتصفية الملاط الناتج عبر مصفاة خلايا بمقاس 70 micron في أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter. اغسل مصفاة الخلايا مرة واحدة ثم قم بترسيب معلق الخلايا المفردة عن طريق الطرد المركزي. وأخيرًا، اغسل الخلايا مرة واحدة في PBS ثم قم بإجراء الطرد المركزي.

بعد ذلك، يتم تحديد عدد الخلايا الحية عن طريق استبعاد صبغة trypan blue. تؤدي بكتيريا e. coli المنتجة لبروتين ovalbumin المرتبط بالبروتين الفلوري السياني إلى تنشيط إنتاج interferon gamma في خلايا OT-II في المختبر، وذلك على عكس e.

بكتيريا coli التي تعبر عن CFP فقط. يوضح التصوير البؤري ثلاثي الأبعاد خارج الجسم (Ex vivo 3D confocal imaging) للأنسجة القولونية للفئران المعدلة وراثياً والتي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر، والتي تم تغذيتها بـ e. coli PCFP ova، وجود البكتيريا المعبرة عن البروتين الفلوري داخل خبايا القولون بالقرب من الخلايا الظهارية المعوية وفي مواقع مشتركة مع الخلايا البلعمية المعوية للمضيف.

في حيوانات OT-II الحمراء، تتميز الخلايا التائية الموجبة لـ CD4 بالتعبير المشترك عن البروتين الفلوري الأحمر وV beta 5.1. وعند تحفيز الفئران المعدلة وراثياً من سلالة BNT والناقصة للخلايا اللمفاوية والمعبرة عن البروتين الفلوري الأخضر، والتي خضعت لزراعة تبني لخلايا تائية موجبة لـ OT-II red وCD4 وCD62 ligand، باستخدام e. coli PCFP ova، فإنها تفقد وزن الجسم بسرعة وتظهر عليها علامات سريرية لالتهاب القولون.

بعد سبعة أيام من نقل الخلايا، قامت قلة فقط من الخلايا البلعمية المضيفة بأخذ عينات من بويضات e. coli PCFP، ولم يتم الكشف عن خلايا OT-II الموجبة للون الأحمر. وبعد 14 يوماً من نقل الخلايا، قامت الخلايا البلعمية المضيفة التي أخذت عينات من e.

تقع بيضات e. coli PCFP على مقربة شديدة من خلايا OT-II الموجبة لـ red التي تم نقلها تبنيًا. وبحلول اليوم 21 بعد نقل الخلايا، يكون عدد كبير من خلايا المضيف قد قام بأخذ عينات من بيضات e. coli PCFP، وتوجد خلايا OT-II الموجبة لـ red المانحة منتشرة في جميع أنحاء الصفيحة المخصوصة للقولون، وتكون في اتصال وثيق مع البلعميات المعوية للمضيف.

عند إتقان هذه التقنية، يمكن إكمالها في غضون أربع ساعات إذا نُفذت بشكل صحيح. وبناءً على هذا الإجراء، يمكن إجراء طرق أخرى مثل صبغ اللمفاويات المعوية وتحليل السيتوكين في المصل للإجابة على أسئلة إضافية حول حالة تنشيط خلايا CD4 T ولتأكيد شدة التهاب القولون. ومع كل تطور، تمهد هذه التقنية الطريق للأبحاث في مجال علم المناعة لاستكشاف الأحداث الدقيقة التي تؤدي إلى داء الأمعاء الالتهابي في نموذج الفأر.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا المناعية من الصفيحة المخصوصة للقولون من أجل التحليلات اللاحقة خارج الجسم (ex vivo).