تطوير التهاب القولون نموذج مدفوعة مستضد لدراسة عرض المستضدات التي كتبها مستضد الخلايا إلى خلايا T
September 18th, 2016
الهدف العام من نموذج التهاب القولون الذي يحركه المستضد هو تحديد ما إذا كانت الخلايا البلعمية أحادية النواة الإيجابية CX3 و CR1 تتفاعل مع الخلايا التائية الإيجابية CD4 وتنشطها أثناء التهاب القولون الخاص بالمستضد وما إذا كان هذا المستجيب المعتمد على الخلايا البلعمية أحادية النواة يحدث داخل الصفيحة المعوية الخاصة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال مرض التهاب الأمعاء ، مثل أنواع التفاعل التي تحدث داخل الخلايا العارضة للمستضد والخلايا التائية المستجيبة في الصفيحة القولونية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بدراسة تفاعل الخلايا المناعية والعناصر التي تؤدي إلى إمراض مرض التهاب الأمعاء.
تستخدم هذه الطريقة نموذج التهاب القولون لنقل الخلايا التائية ، حيث يتم نقل خلايا CD4 T الساذجة الخاصة بمستضد الفلورسنت الأحمر إلى المضيف الذي يعاني من نقص المناعة ، مما يعبر عن البروتين الفلوري الأخضر في الخلايا أحادية النواة. يتبع نقل الخلايا التزقيم الفموي للبكتيريا التي تعبر عن مستضد الفلورسنت الأزرق. يمكن مراقبة الأحداث المناعية التي تحدث في الصفيحة المعوية للمضيفين في مراحل مختلفة من تطور المرض.
استخدم مقص التشريح لفتح القولون طوليا وغسل المنديل في طبق بتري يحتوي على 25 مل من PBS لإزالة أي حطام ومخاط. قطع القولون إلى قطع من خمسة إلى ثمانية ملليمترات وضع الأجزاء الناتجة في 20 مل من DPBS الطازج بدون الكالسيوم والمغنيسيوم ، مع استكمال عشرة ملليمولار HEPES وخمسة مللي مولار EDTA. دوامة الأنبوب مع العينة لمدة 30 ثانية على السرعة القصوى.
ثم احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة عشر دقائق مع رج لطيف لإزالة الظهارة. في نهاية الحضانة ، دوامة مرة أخرى لمدة 30 ثانية. ثم تخلص من المادة الطافية التي تحتوي على الخلايا الظهارية.
انقل قطع المناديل إلى أنبوب جديد يحتوي على 20 مل من PBS و HEPES و EDTA الطازج ، وكرر الحضانة بخطوات الدوامة قبل وبعد. بعد التكرار الثالث ، تتم إزالة جميع الخلايا الظهارية ويكون المادة الطافية واضحة. اغسل شظايا الأنسجة برفق في PBS لإزالة أي خلايا ظهارية متبقية.
قم بتقطيع شظايا الأنسجة إلى قطعتين في ملليمترين ونقل القطع للهضم في عشرة ملليمترات من وسط RPI ، مع استكمال 0.5 ملليغرام لكل مليلتر من نوع الكولاجيناز من النوع ثمانية وعشر وحدات لكل مليلتر من الحمض النووي واحد. دوامة العينات لمدة 30 ثانية. بعد ذلك ، قم باحتضان قطع المناديل على حرارة 37 درجة مئوية مع الرج لمدة 30 إلى 35 دقيقة وقم بدوامة الأنبوب كل خمس دقائق أثناء الحضانة.
عندما يتم هضم الأنسجة ، قم بتصفية الملاط الناتج من خلال مصفاة خلية 70 ميكرون في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. اغسل مصفاة الخلية مرة واحدة وقم بتدوير معلق الخلية المفردة عن طريق الطرد المركزي. أخيرا ، اغسل الخلايا مرة واحدة في PBS وأجهزة الطرد المركزي.
ثم حدد عدد الخلايا القابلة للحياة عن طريق استبعاد التريبان الأزرق. بروتين الفلورسنت السماوي ينتج بروتين البيضافي الإشريكية القولونية ينشط إنتاج إنترفيرون جاما في خلايا OT-II في المختبر على عكس E.
القولونية التي تعبر عن CFP فقط. Ex vivo 3D التصوير متحد البؤر لأنسجة القولون لبروتين الفلورسنت الأخضر المعدلة وراثيا الذي يعبر عن الفئران ، الذي يتغذى على بكتريا قولونية PCFP يوضح البويضات وجود البكتيريا التي تعبر عن البروتين الفلوري داخل الخبايا القولونية بالقرب من الخلايا الظهارية المعوية ومتوضعة مع الخلايا البلعمية المعوية المضيفة.
في الحمراء OT-II ، تتميز الخلايا التائية الإيجابية CD4 بتعبيرها المشترك عن البروتين الفلوري الأحمر و V beta خمس نقاط واحد. عند التحدي مع بكتريا قولونية PCFP البويضات ، الفئران المعدلة وراثيا بالبروتين الفلوري الأخضر التي تعاني من نقص الخلايا الليمفاوية BNT والتي تم زرعها بالتبني مع الخلايا التائية الإيجابية CD62 الحمراء OT-II CD62 الإيجابية تفقد وزن الجسم بسرعة وتظهر علامات سريرية لالتهاب القولون.
بعد سبعة أيام من نقل الخلايا ، لم يتم أخذ عينات سوى عدد قليل من الخلايا البلعمية المضيفة من بكتريا قولونية PCFP البويضات ولم يتم اكتشاف الخلايا الإيجابية الحمراء OT-II. بعد 14 يوما من نقل الخلايا ، الخلايا البلعمية المضيفة التي أخذت عينات من E.
توجدبويضات القولونية PCFP على مقربة من الخلايا الحمراء الإيجابية OT-II المنقولة بالتبني. بحلول 21 يوما بعد نقل الخلايا ، قام عدد كبير من الخلايا المضيفة بأخذ عينات من بكتريا قولونية بويضات PCFP والخلايا الإيجابية الحمراء OT-II المانحة ، والتي تم العثور عليها منتشرة في جميع أنحاء الصفيحة القولونية المخصوصة ، على اتصال وثيق بالخلايا البلعمية المعوية المضيفة.
عند إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تلطيخ الخلايا الليمفاوية المعوية وتحليل السيتوكين في الدم للإجابة على أسئلة إضافية حول حالة تنشيط الخلايا التائية CD4 وتأكيد شدة التهاب القولون. بعد كل تطور ، تمهد هذه التقنية الطريق للبحث في مجال وعلم المناعة لاستكشاف الأحداث الصغيرة التي تؤدي إلى مرض التهاب الأمعاء في نموذج الفأر.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا المناعية للصفيحة القولونية لتحليل خارج الجسم الحي.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
النظرة العامة
تستخدم هذه الدراسة نموذج التهاب القولون المعتمد على المستضد للتحقيق في التفاعلات بين CX3، الخلايا البلعمية أحادية النواة الإيجابية لـ CR1 والخلايا التائية الإيجابية لـ CD4. يسمح النموذج بمراقبة الأحداث المناعية في الصفيحة المخاطية المعوية أثناء تطور المرض.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم المناعة
- أمراض الأمعاء الالتهابية
- التفاعلات الخلوية
الخلفية
- فهم دور الخلايا البلعمية أحادية النواة في تفعيل الخلايا التائية.
- استكشاف تفاعلات الخلايا المناعية في الصفيحة المخاطية القولونية.
- التحقيق في الآليات المسببة للأمراض في أمراض الأمعاء الالتهابية.
- استخدام البروتينات الفلورية لتتبع الاستجابات المناعية.
غرض الدراسة
- لتحديد التفاعل بين الخلايا البلعمية أحادية النواة والخلايا التائية CD4.
- لتقييم توسع الخلايا التائية الفاعلة في الصفيحة المخاطية المعوية.
- لتوفير رؤى حول آليات أمراض الأمعاء الالتهابية.
الطرق المستخدمة
- النقل المعتمد لخلايا OT-II CD4 + T إلى الفئران RAG -/-.
- استخدام البروتينات الفلورية لتمييز الخلايا المناعية.
- الري بالفم لـ E.coli التي تعبر عن البروتين المبيضي المصهور إلى CFP.
- مراقبة الأحداث المناعية في مراحل مختلفة من المرض.
النتائج الرئيسية
- تحديد التفاعلات بين الخلايا البلعمية أحادية النواة والخلايا التائية.
- دليل على توسع الخلايا التائية الفاعلة في الصفيحة المخاطية المعوية.
- رؤى حول مسببيّة أمراض الأمعاء الالتهابية.
- تبيان فائدة نموذج التهاب القولون بنقل الخلايا التائية.
الاستنتاجات
- تسلط الدراسة الضوء على التفاعلات الحيوية في الاستجابة المناعية أثناء التهاب القولون.
- تساهم النتائج في فهم آليات أمراض الأمعاء الالتهابية.
- يوفر النموذج إطارًا للبحث المستقبلي في علم المناعة.
الأسئلة المتكررة
Executive Industry Relevance
This antigen-driven colitis model enables mechanistic interrogation of antigen-presenting cell and T cell interactions in a defined immunological context, supporting target validation in inflammatory bowel disease research. By providing a reproducible system to study pathogenic immune cell crosstalk in the lamina propria, it enhances predictive confidence in preclinical de-risking of immunomodulatory candidates. The model aligns with early discovery workflows focused on pathway clarification and biological target engagement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding antigen-specific T cell activation by mononuclear phagocytes.
- Operational Value: Provides a defined antigen-driven system to clarify biological pathways involved in colitis pathogenesis.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by isolating effector T cell expansion events in intestinal tissue.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated biological systems with fluorescently labeled immune cells for downstream ex vivo analysis.
- Quantitative Outputs: Enables measurement of immune cell interactions and cytokine production in response to defined antigen exposure.
- Reproducibility: Standardized cell isolation and tissue processing support consistent immune event monitoring across experimental replicates.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models antigen-driven intestinal inflammation to study mechanisms relevant to subsets of inflammatory bowel disease.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase immune interaction data with preclinical validation of therapeutic candidates.
- Risk-Adjusted Decisions: Facilitates evaluation of target engagement and mechanistic effects prior to lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The method supports early discovery biology by enabling hypothesis testing of antigen-presenting cell functions in T cell activation, positioning it before lead identification stages. It generates quantitative immune event data useful for analytics-driven comparison of experimental conditions in immunology screening. The system is designed as a reusable platform for studying immune-mediated pathways across multiple target validation campaigns.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification of antigen-specific immune responses in the gut.
- Screening: Delivers reproducible immune cell isolation and stimulation protocols for compound or modulator evaluation.
- Analytics: Provides measurable readouts such as interferon gamma production and immune cell localization for condition comparison.
- Translational Research: Connects mechanistic insights to preclinical continuity through defined antigen-driven disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for studying APC-T cell interactions applicable to multiple immunology targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in immune cell interactions.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined antigen challenge and cell transfer protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of target-mediated biological effects.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immunomodulatory candidates based on lamina propria immune event data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunology, flow cytometry, and fluorescent microscopy for immune cell isolation and analysis.
- Dependent on access to transgenic mouse models, fluorescent protein-expressing bacteria, and intestinal tissue processing equipment.
- Necessitates cross-team standardization of cell transfer timing, antigen dosing, and tissue harvest schedules.
- Adaptation considerations include model system compatibility with different antigen-specific T cell receptors and phagocyte markers.
- Practical limitations include the technical complexity of lamina propria cell isolation and the need for multi-day disease development monitoring.
