عدوى المسالك البولية في نموذج حيوانات صغيرة: قسطرة Transurethral من الفئران الذكور والإناث

الهدف العام من هذا النهج التجريبي هو التحقيق في الاستجابة المناعية لعدوى المسالك البولية ، ومنع المقارنة المباشرة بين ذكور وإناث. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية لعلم المناعة المخاطية المتعلقة بكيفية استجابة الذكور والإناث لعدوى المسالك البولية. الميزة الرئيسية هي أن العدوى تنشأ عن طريق الجذر الطبيعي.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة بعد ملاحظة عدد المرات التي يذكر فيها أن تركيب مثانة الفئران الذكور أمر مستحيل. على الرغم من أن هذه الطريقة ستوفر نظرة ثاقبة لعدوى المسالك البولية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على دراسات الأمراض الأخرى ، مثل سرطان المثانة. للبدء ، قم بإعداد قنية واحدة للوصول إلى الوريد للأطفال لكل مجموعة من الفئران المصابة.

باستخدام آلية الزنبرك المدمجة ، قم بتجريد كل كانولا من إبرتها وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تخلص من الإبر ، مع الحفاظ على القناة البلاستيكية الوريدية فقط. عقيم القسطرة في غطاء التدفق الصفحي لدورة واحدة للأشعة فوق البنفسجية تتراوح من 25 إلى 30 دقيقة تقريبا.

بعد الذهاب إلى ثقافة بين عشية وضحاها من الإشريكية الممرضة للبول القولوني, أو UPEC, وفقا لبروتوكول النص, تدوير المعلق البكتيري في جهاز طرد مركزي دقيق على سطح الطاولة عند 17, 000 مرة غرام لمدة دقيقة واحدة, وإعادة تعليق الحبيبات البكتيرية الناتجة في اثنين من 10 إلى CFU الثامن لكل مليلتر في PBS. قم بتخفيف كمية معلقة بشكل متسلسل ، ولوحة على LB أجار بالمضادات الحيوية إذا كان ذلك مناسبا ، لتحديد اللقاح الدقيق لكل عدوى. ارسم اللقاح البكتيري في حقنة سعة مليلتر واحد ، وقم بإرفاق القسطرة بنهاية المحقنة.

اضغط على المحقنة لإزالة أي هواء ، واضغط على المكبس لملء مساحة الهواء الميتة في القسطرة قبل البدء في التقطير. بعد تخدير أنثى الفأر وفقا لبروتوكول معتمد ، ضع الحيوان مستلقا ، واضغط على أسفل البطن لتفريغ المثانة من البول. تبدو المثانة الممتلئة وكأنها حبة البازلاء تحت الجلد ، بين القمم الحرقفية.

عندما تكون المثانة فارغة ، باستخدام اليد غير المهيمنة ، ضع الإبهام على الذيل وإصبع من نفس اليد على بطن الفأر ، واضغط برفق في اتجاهات متعارضة لتثبيت الماوس بإحكام في مكانه. بعد ذلك ، ضع طرف القسطرة بشكل عمودي على الفأر عند فتحة مجرى البول ، ثم ، بضغط برفق ، حرك القسطرة في مجرى البول حتى يلتقي المحور بفتحة مجرى البول ، مع خفض المحقنة في نفس الوقت بحيث تكون موازية لسطح العمل. بمجرد وضع القسطرة في مكانها، استخدم إصبعا من اليد غير المهيمنة التي تستقر على بطن الفأر لسحب جلد البطن برفق شديد نحو رأس الفأر.

لاحظ أن فتحة مجرى البول لن تتحرك. ومع ذلك ، إذا كانت القسطرة في المهبل ، فسوف يتحرك النسيج لأعلى وبعيدا عن القسطرة. باستخدام محور القسطرة مقابل فتحة مجرى البول ، قم بتوزيع 15 ميكرولترا من اللقاح البكتيري ببطء.

يقلل معدل التثبيت البطيء من الارتجاع المثاني الحالبي إلى الكلى. قم بإزالة القسطرة ببطء لمنع التسرب. ثم ضع في قفصه في وضع ضعيف.

لتلقيح ذكور الفئران ، ضع ملقطين للإبهام في الجمجمة والذيلية على الأعضاء التناسلية الخارجية للفئران. اسحب القلفة لكشف قضيب الغدة بالكامل. بعد ذلك ، بمجرد وضع القضيب خارجيا ، حرر ملقط الإبهام.

أعد وضع الملقط لتثبيت القضيب البارز بشكل عمودي على الحيوان ، مع إمساك العضو برفق ولكن مشدود. ثم من خلال الفتحة الصغيرة في طرف صماخ مجرى البول ، أدخل القسطرة بعناية وقم بتوجيهها برفق إلى القضيب باستخدام ملقط للحفاظ على التوتر برفق. بمجرد أن يلتقي محور القسطرة بطرف القضيب ، قم بتوزيع 50 ميكرولترا من اللقاح ببطء شديد ، مع الحفاظ على موضع القضيب.

لاحظ جودة التقطير وفقا لدرجة جودة التقطير المحددة مسبقا ، مثل تلك الموضحة هنا. اسحب القسطرة ببطء على مدى خمس ثوان لمنع تسرب اللقاح. ضع الفأر في قفصه في وضع ضعيف.

يجب أن يبدأ في التعافي بعد 30 إلى 45 دقيقة من إعطاء التخدير. بعد التضحية بالفئران وفقا لبروتوكول معتمد ، استخدم 70٪ Epinal لترطيب البطن جيدا لتقليل التلوث بالفراء. باستخدام المقص ، قم بعمل شق بطول سنتيمترين عبر الثلث السفلي من بطن الفأر ، وقم بإزالة المثانة وأي أعضاء أخرى مرغوبة بشكل معقم

انقل الأعضاء إلى خمسة مليلتر من البولي بروبيلين أنابيب الغطاء المفاجئ ، تحتوي على مليلتر واحد من PBS المعقم واحتفظ بجميع العينات على الجليد. باستخدام الخالط اليدوي ، قم بتجانس الأعضاء حتى لا يتبقى أي نسيج صلب تقريبا. تخلص من أي أنسجة دهنية لامعة باللون البيج والأبيض لا تتجانس جيدا.

بعد ذلك ، استخدم Epinal ، متبوعا ب PBS لغسل الخالط بين كل مجموعة تجريبية أو عضوية. بعد تحضير التخفيفات المتسلسلة لتعليق الأعضاء المتجانسة ، يتم تخفيف الألواح على ألواح أجار LB ، مع المضادات الحيوية عند الاقتضاء ، وتحتضن عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. لإجراء قياس التدفق الخلوي على أنسجة المثانة ، بعد عزل المثانة كما هو موضح سابقا في هذا الفيديو ، استخدم المقص لفرم الأنسجة جيدا.

أضف مثانة مفرومة واحدة لكل أنبوب يحتوي على عازلة الهضم. ثم رج الأنبوب لغسل الأنسجة المفرومة في محلول الهضم ، واحتفظ به على الثلج حتى يتم تشريح جميع المثانات وفرمها. احتضان المثانة المفرومة عند 37 درجة مئوية ، لمدة 60 إلى 75 دقيقة مع هز قوي باليد لمدة خمس ثوان ، كل 15 دقيقة.

عندما يكون للأنسجة مظهر زجاجي شفاف يشبه المناديل الورقية المبللة ، يكون الهضم كاملا. قم بتعطيل إنزيمات الهضم عن طريق إضافة ملليلترين إلى ثلاثة ملليلترات من المخزن الخلوي لقياس التدفق المثلج ، واخلطه برفق. ثم ضع الأنابيب على الجليد.

لضمان تعليق أحادي الخلية ، ولإزالة أي نسيج ضام ، قم بتمرير محتويات الأنبوب من خلال مرشح 100 ميكرومتر يوضع في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. ثم ، بنهاية مكبس المحقنة ، اضغط برفق على أي أنسجة متبقية من خلال الفلتر. اغسل الفلتر بملليلترين إضافيين من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي ، واحتفظ بالعينات على الجليد.

يغسل العينات بالطرد المركزي عند 200 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة سبع دقائق. أعد تعليق الكريات في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي الذي يحتوي على كتلة Fc ، مخفف إلى خمسة ميكروغرام لكل مليلتر ، وانقله إلى صفيحة سفلية مستديرة 96 جيدا. بعد 10 إلى 15 دقيقة ، أضف 100 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة المطلوب إلى كل عينة.

ثم احتضان العينات على الجليد المحمي من الضوء لمدة 30 إلى 45 دقيقة. اغسل العينات بالطرد المركزي عند 200 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة سبع دقائق. أخيرا ، أعد تعليق كريات الخلية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي ، وقم بتمرير العينات عبر مصفاة خلية 40 ميكرومتر على أنبوب بوليسترين سعة خمسة ملليلتر ، قبل الحصول عليها مباشرة على مقياس التدفق الخلوي.

يوضح هذا الشكل بيانات تمثيلية من الفئران المصابة لمدة 24 ساعة. كان العبء البكتيري مكافئا بين ذكور وإناث الفئران في 24 ساعة بعد الإصابة. لتحديد ما إذا كان فقدان اللقاح في وقت الإصابة يؤثر على إنشاء العدوى ، تم تسجيل كل تقطير على مقياس من واحد إلى خمسة ، مع كون واحد هو الأمثل.

تم تحديد الاستعمار البكتيري بعد 24 ساعة من الإصابة. لم يتم العثور على فروق ذات دلالة إحصائية بين CFU التي تم الحصول عليها من ذات درجات التقطير المختلفة كما تم تقييمها من خلال اختبار Kruskal-Wallis غير المعلمي ، ومقارنة متوسط رتبة كل عمود مع متوسط رتبة كل عمود آخر ، وتصحيح المقارنات المتعددة باستخدام اختبار دن. يمكن الاستنتاج أن التقطير دون المستوى الأمثل ، مما يؤدي إلى تسرب كبير للتلقيح البكتيري أثناء الإصابة ، لا يؤثر بشكل كبير على الاستعمار البكتيري في 24 ساعة.

الأهم من ذلك ، أن تكرار التقطير دون المستوى الأمثل سينخفض مع الممارسة. أخيرا ، في حين أن عدد الخلايا المناعية الإيجابية CD45 الموجودة في الساذجة لم يكن مختلفا بين إناث الفئران وذكورها ، كانت هناك زيادة ذات دلالة إحصائية في التسلل إلى مثانات إناث الفئران المصابة. أثناء محاولة القسطرة ، من المهم استخدام حركات بطيئة ولطيفة.

مع تطورها ، ساعدتنا هذه التقنية على استكشاف الاختلافات القائمة على الجنس في المناعة في مثانة الذكور والإناث.