القبض على وإطلاق قابلة للحياة تعميم الخلايا السرطانية من الدم

الهدف العام من هذه التقنية هو التقاط الخلايا السرطانية المنتشرة القابلة للحياة أو الخلايا السرطانية السرطانية من الدم الكامل. يمكن وضع CTCs هذه في المزرعة أو استخدامها في التحليلات النهائية التي تتطلب عينات غير ثابتة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال ورم خبيث.

يمكن استخدامه أيضا لمتابعة تطور المرض والاستجابة للعلاج وتقييم مخاطر تكراره. تتمثل ميزة هذه التقنية في القدرة على إجراء التقاط خال من الملصقات ل CTCs القابلة للحياة من أي ورم صلب مع البقاء مستقلا عن تعبير المؤشرات الحيوية. خطرت لنا في البداية فكرة إطلاق CTCs من المرشح لأننا أردنا إجراء تحليل الحمض النووي الريبي في اتجاه مجرى النهر واستزراع CTCs ، بدلا من زراعتها في الموقع على المرشح.

لبدء التجربة ، قم بوزن ما يكفي من PIPAAm لتحضير محلول وزن 10٪ لكل حجم في أنبوب سعة 15 مليلتر يحتوي على البيوتانول. دوامة الأنبوب حتى يصبح المحلول صافيا. بعد ذلك ، قم بتقطيع شرائح المجهر البلاستيكي إلى مربعات بحجم 12 ملم × 12 ملم تقريبا باستخدام مقص.

بعد ذلك ، باستخدام زوج حاد من المقص ذو الحواف المستقيمة ، قم بقص رقاقة مرشح دقيق ذات مسام الفتحة إلى ثمانية ملم مربعات في ثمانية ملليمترات وضع هذه القطع مباشرة على المربعات البلاستيكية. باستخدام شريط فيلم بوليميد ، قم بتأمين المرشحات المقطوعة على المربعات البلاستيكية ، فقط على حافة وزاوية المرشح بحيث لا يتم تغطية مساحة المرشح على الأقل سبعة ملليمترات في سبعة ملليمترات بواسطة الشريط. ضع المرشح الدقيق المثبت على المربع البلاستيكي على ظرف الفراغ الخاص بآلة الطلاء الدورانية.

قم ببرمجة المغطي الدوار على الوصفة التالية. بعد ذلك، باستخدام ماصة نقل البلاستيك القياسية، قم بتوزيع ما يكفي من الوزن بنسبة 10٪ لكل حجم محلول PIPAAm لتغطية سطح المرشح الدقيق بالكامل وبدء تشغيل المغطي الدوار. بعد اكتمال الطلاء ، قم بإزالة المرشح الدقيق المطلي ب PIPAAm من آلة الطلاء الدوارة واترك الفلتر متصلا بالمربع البلاستيكي أثناء التخزين.

انتقل إلى مجموعة كاسيت الترشيح وأعد ترطيب الفلتر الدقيق المطلي ب PIPAAm في درجة حرارة الغرفة عن طريق وضع الفلتر الدقيق في طبق بتري. أضف 1X PBS حتى يتم غمر المرشح الدقيق بالكامل. بعد خطوة الترطيب ، حرر الفلتر من المربع البلاستيكي عن طريق تقشير أو قطع شريط فيلم البوليميد من الفلتر.

بعد ذلك ، قم بتجميع المرشح الدقيق في كاسيت الترشيح عن طريق وضع المرشح الدقيق بين قطعة الأكريليك العلوية والسفلية على طول قطع PDMS التي تعمل كحشية. بعد ذلك ، قم بتثبيت كاسيت الأكريليك بمشابك لتأمين الفلتر ، لتوفير ختم محكم. قم بتسخين ثلاثة ملليلتر من وسط زراعة خلايا McCoy إلى 37 درجة مئوية.

أضف 7.5 مل من محلول الملح المتوازن من هانك أو HBSS إلى 7.5 مل من عينة الدم وشفط هذا الدم المخفف في حقنة سعة 25 مل. بعد تحديد الجزء العلوي من الكاسيت ، قم بإشراك كاسيت الترشيح بالمحقنة وضعها على مضخة المحقنة. اضبط مضخة الحقنة على معدل تدفق 75 مليلتر في الساعة.

ضع أنبوبا سعة 50 مليلتر في الأسفل لتجميع التدفق من خلال المضخة وبدء تشغيلها. بعد اكتمال الترشيح ، قم بفصل شريط الترشيح ، مع ملاحظة الجانب العلوي الذي يحتوي على الخلايا العالقة في السطح المطلي ب PIPAAm. استنشق ملليلتر واحد من وسط الثقافة الدافئة في حقنة جديدة.

مرة أخرى ، حدد الجزء العلوي من الكاسيت ثم أعد تعشيق علبة الترشيح بالمحقنة التي تحتوي على الوسيط وقم بإشراك الطرف السفلي من الكاسيت بحيث يكون السطح المطلي PIPAAm للمرشح متجها بعيدا عن المحقنة. ثم ضع المحقنة مرة أخرى على مضخة الحقنة وأمسك لوحة الآبار الستة أسفل كاسيت الترشيح مباشرة. اضبط معدل التدفق وابدأ تشغيل المضخة.

مرر كل الوسيط عبر الفلتر واجمع التدفق من خلال طبق بتري. انتظر حتى يمر كل الوسيط ، ثم أوقف المضخة وقم بإزالة المحقنة وعلبة الترشيح من المضخة. بعد ذلك ، افصل كاسيت الترشيح عن المحقنة وافتحه لاسترداد الفلتر من الكاسيت.

ضع الفلتر بحيث يكون سطح PIPAAm متجها لأسفل في نفس طبق بتري المستخدم لجمع التدفق العكسي عند تحرير الخلايا من المسام. أضيفي باقي الوسط الدافئ وضعي طبق بتري في حاضنة ثقافة على درجة حرارة 37 درجة مئوية. بمجرد استرداد الفلتر من الكاسيت ، من الأهمية بمكان وضعه في اللوحة بحيث تكون الخلايا متجهة لأسفل وإذا لزم الأمر ، قم بهزه برفق في الوسائط لضمان فصل الخلايا عن الفلتر.

بعد 24 ساعة في الثقافة ، قم بإزالة المرشح الدقيق بعناية باستخدام الملقط وتخلص من الفلتر. أعد تعليق كريات الدم الحمراء وخلايا الدم المحيطية أحادية النواة برفق باستخدام ماصة سعة 1000 ميكرو لتر. من الأهمية بمكان أن تكون لطيفا للغاية عند إعادة تعليق كريات الدم الحمراء و PBMCs لتجنب سحب كريات الدم الحمراء من الخلايا السرطانية.

قم بإزالة الوسط بالكامل الذي يحتوي على كريات الدم الحمراء المعلقة و PBMCs بعناية مع ترك الخلايا السرطانية المرفقة واستبدل الخلايا بوسط جديد ، دافئ مسبقا إلى 37 درجة مئوية. المضي قدما في تقييم جدوى لجنة مكافحة الإرهاب. باستخدام دم المتبرعين الأصحاء المليء بالخلايا السرطانية المستنبتة ، حققت تقنية الاستجابة الحرارية لإطلاق الخلايا السرطانية المنتشرة القابلة للحياة أو CTCs ، كفاءة التقاط وإطلاقها واسترجاعها بنسبة 94٪ 82٪ و 77٪ على التوالي.

كانت كفاءة إطلاق واسترجاع المرشحات غير المطلية أقل بكثير. تم إجراء اختبار ميت حي لتقييم صلاحية الخلية قبل الارتفاع في الدم وبعد إطلاقه. ظلت الخلايا قابلة للحياة بعد الإطلاق وتوسعت في الثقافة بسرعة.

تم استرداد خلايا SKBr-3 من الدم بواسطة مرشح الفتحة المطلي PIPAAm وطلاءها على لوحة 48 بئر. في 16 ساعة في المزرعة ، تلتصق الخلايا السرطانية بلوحة الثقافة جنبا إلى جنب مع كريات الدم الحمراء منخفضة التوتر والكريات البيض التي استقرت في الجزء السفلي من اللوحة. تمت إزالة الخلايا غير الملتصقة بعد الغسيل فقط تاركة الخلايا السرطانية الملتصقة على اللوحة.

يمكن استخدام نفس المرشحات لالتقاط الخلايا الثابتة ، سواء للتعداد أو التوصيفات الجزيئية ل CTCs لتتبع تطور السرطان وإدارة السرطان بشكل أفضل. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال CTCs مما مكن من التوصيف الوظيفي لهذه الخلايا لاستكشاف أهداف الأدوية المستقبلية مع اتخاذ خطوة نحو الطب الشخصي.