نمو المؤجل تثبيط الفحص لتحديد تأثير مضادات الميكروبات المستمدة البكتيريا على المنافسة

الهدف العام من هذا البروتوكول هو فحص التنافس بين عزلة بكتيرية وأخرى بطريقة كمية ونوعية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية تتعلق بالتحقيقات في الإقصاء التنافسي داخل المجتمعات البكتيرية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تعكس ما يحدث بالفعل في المجتمع البكتيري.

يجب أن تكون العزلات الغازية قادرة على البقاء على قيد الحياة رغم التأثيرات المثبطة للعزلات المستقرة لكي تنجح عملية الغزو. ستقوم إيما كرانك، وهي طالبة دراسات عليا في بيولوجيا المستشفيات، بتوضيح هذا الإجراء. للبدء، قم بتحضير آجار صب心 الدماغ والقلب أو BHI agar وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.

قم بتعقيم الآجار باستخدام الموصدة (Autoclave) عند درجة حرارة 121 °C وضغط 15 psi لمدة 20 دقيقة. صُب كميات مقدارها 15 مل من آجار BHI المعقم في أطباق بتري معقمة، واترك الآجار ليتصلب. قم بتحضير مرق BHI وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، وانقل كميات مقدارها 10 مل إلى زجاجات عالمية سعة 28 مل.

بعد ذلك، يتم تعقيم مرق BHI في autoclave لمدة 20 دقيقة. ولتحضير زجاجات المبخر، ابدأ بتفكيك الزجاجات، ثم رش عامل تنظيف نشط سطحيًا بتركيز 5% عبر المبخر للتخلص من الملوثات الداخلية.

بعد ذلك، يتم نقع زجاجة المبخر والغطاء والمبخر في عامل التنظيف طوال الليل. وفي اليوم التالي، يتم تجفيف المبخر والغطاء والزجاجات تحت غطاء تدفق الهواء المعقم. ثم تُملأ الزجاجات بـ 70%ethanol.

بعد ذلك، أعد تركيب المبخر ورش بعض الإيثانول من خلاله. ضع الغطاء على المبخر واحفظه وبداخله الإيثانول حتى وقت الاستخدام. وقبل الاستخدام، استخدم مرق BHI المعقم لشطف الزجاجة بطريقة معقمة، ثم رش المرق من خلال المبخر.

لتحضير مزارع بكتيرية ليلة واحدة، يتم تخطيط سلالات المنافس والمثبط على طبق آجار BHI معقم، ثم تحضن هوائيًا عند 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة تقريبًا. وفي زجاجة عامة سعة 28 مل، يتم تلقيح 10 مل من مرق BHI المعقم بمستعمرة واحدة من سلالة البكتيريا المنافسة المطلوبة. تحضن المزرعة في هزاز مداري عام عند 37 درجة مئوية وسرعة 250 RPM ليلة واحدة.

في اليوم التالي، تأكد من أن أطباق الآجار جافة تماماً ولا يوجد تكثف على الغطاء، وذلك لمنع انتشار التلقيح على الطبق. انقل 25 µL من المزرعة الليلية إلى مركز أطباق الآجار، مع تجنب الضغط الكامل على مكبس الماصة لمنع تكون فقاعات هواء قد تؤدي إلى رش المزرعة عبر الآجار. اترك المزرعة لتجف في درجة حرارة الغرفة للحد من انتشار المزرعة.

بعد ذلك، تُحضن أطباق الآجار عند 37 درجة مئوية هوائياً طوال الليل. وبعد تنمية المزرعة ليلاً، ومع العمل داخل كابينة سلامة من المستوى الثاني مبطنة بورق ماص، يُستخدم مرق BHI لتخفيف المزرعة بمقدار عشرة أضعاف للحصول على ما يقرب من أربعة في عشرة أس 6 CFU لكل milliliter. ثم يُصب المزرعة المخففة في زجاجة بخاخ عطر بلاستيكية معقمة.

لإجراء مقايسة تثبيط النمو المؤجل، قم برش المزرعة من خلال كل واحدة من زجاجات التبخير لضمان تحميل المزرعة في آلية الرش قبل الرش على الآجار. من مسافة تقريبية تبلغ 15 سنتيمتر فوق الآجار، رش ما يقرب من 250 µL من المزرعة المخففة فوق سطح الآجار بالكامل. حضن الأطباق عند 37 °C هوائيًا طوال الليل.

لتفسير تثبيط النمو المؤجل، قم بقياس منطقة تثبيط النمو للسلالة المنافسة المرشوشة بالملليمترات، مع طرح قطر البقعة المركزية للسلالة المنتجة للمثبط. وأخيرًا، سجل درجة الوضوح لمناطق التثبيط وفقًا لبروتوكول النص. وكما هو موضح في هذا الشكل، يجب أن تكون نتائج المقايسة ملحوظة كاختلاف في السلالة المنافسة المتراكبة بالقرب من السلالة المنتجة للمثبط الموضعة مركزيًا.

يمكن أن تكون الاختلافات عبارة عن تثبيط كامل، أو تثبيط جزئي، أو عدم وجود تثبيط، أو ارتباط إيجابي. يقارن هذا الرسم البياني مناطق التثبيط بين العزلات المنتجة للمثبطات، والتي قد تكون نتيجة لكمية المادة المضادة للميكروبات المنتجة، أو قدرة المثبط على الانتشار عبر الوسط، أو نوع المثبط المنتج، أو مستوى مقاومة السلالة المنافسة للمثبطات. يوضح هذا المثال أنه إذا كانت مزرعة المنافس المختبرة مخففة للغاية، فستظهر منطقة التثبيط أكبر وبحافة أقل وضوحًا مما يُلاحظ عادةً.

إذا لم يتم تجفيف بقعة السلالة المنتجة للمثبط تماماً قبل الحضن طوال الليل، فستنتشر سلالة المثبط ولن تشكل بقعة محددة تماماً. وبدلاً من ذلك، إذا لم يتم رش السلالة المنافسة بشكل متساوٍ، فقد يؤدي ذلك إلى انتشار غير متكافئ للبكتيريا. وأخيراً، إذا كانت السلالة المنافسة مركزة جداً، فقد تنمو فوق سلالة المثبط، وفي الحالات القصوى قد يؤدي ذلك إلى عكس الأدوار بين السلالة المنافسة وسلالة المثبط.

بمجرد إتقان هذه التقنية، سيستغرق تنفيذها ساعة واحدة موزعة على أربعة أيام لكل زوج من العزلات التي يتم اختبارها. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر الرش بشكل متساوٍ مع ضمان تكرار جيد بين المقاييس. وبعد اتباع هذا الإجراء، يمكن دمج بيانات التثبيط مع البيانات التصنيفية المتعلقة بوجود أو غياب نوع بكتيري معين من المجتمع الحيوي.

من الممكن حينئذٍ تحديد ما إذا كانت التأثيرات المثبطة تؤثر على قدرة النوع على الاستعمار في بيئة ما. وتسمح هذه التقنية، بعد تطويرها، للباحثين في مجال الميكروبيومات المجتمعية باستكشاف آثار تباين السمات، مثل التنبؤ بالببتيدات المضادة للميكروبات في بنية المجتمع في حالة الاستبعاد التنافسي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية مقارنة قدرة عزلة بكتيرية واحدة على تثبيط نمو عزلة أخرى تنافسياً، وذلك بطريقة نوعية وكمية على حد سواء.

لا تنسَ أن العمل مع البكتيريا المتطايرة في الهواء يمكن أن يكون خطيراً للغاية، ويجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة عند تنفيذ هذا الإجراء، مثل العمل داخل كابينة سلامة من المستوى الثاني وارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة.