القياس الكمي لمستويات حمض الريتينويك النسبية في E8.5 الأجنة وNeurosphere الثقافات باستخدام F9 نادر-Lacz القائم على خلية مراسل الفحص

الهدف العام من هذا الإجراء هو القياس الكمي لمستويات حمض الريتينويك النسبية في تحضيرات الأنسجة، مثل أجنة الفئران في اليوم الجنيني 8.5 (E8.5) أو مزارع الكريات العصبية البالغة، وذلك باستخدام مقايسة مراسل قائمة على الخلايا. وبينما تم توصيف مسار تأشير RA بشكل جيد، فإن القياس النسيجي المباشر لـ RA غير ممكن من الناحية التقنية. ويمكن لهذه المقايسة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية حول كيفية تأثير الطفرات الجينية على مستويات RA.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في كونها عالية الحساسية ومتعددة الاستخدامات، مع القدرة على قياس نطاق واسع من تركيزات RA في مجموعة متنوعة من عينات الأنسجة. وعلى الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية مباشرة لتحديد مستويات RA في عينات الأنسجة المختلفة، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً في دراسات أخرى، مثل تحديد وجود أو غياب الإنزيمات الاستقلابية لـ RA من خلال مراقبة التغيرات في مستويات RA. قبل البدء في أي تجارب، اختبر استجابة خلايا F9 RARE-LacZ لـ RA. أضف 1 nM من all-trans RA إلى خلايا F9 RARE-LacZ المزروعة في طبق مكون من 96 بئراً.

بعد ذلك، يتم تحضين الطبق وزراعته عند 37 درجة مئوية طوال الليل. وفي اليوم التالي، يتم إجراء صبغ LacZ وفحص الخلايا للتحقق من وجود راسب أزرق. إذا لم يكن اللون موحدًا في جميع الخلايا، يتم البدء في استنساخ الخلايا فرعيًا.

قسّم المزارع المختارة في أطباق قطرها 10 سنتيمتر بتركيز 100,000 خلية لكل 10 ملليلتر. بعد يومين من الزرع، جهز طبقاً يحتوي على 24 بئراً بوضع 500 ميكرولتر من الجيلاتين بتركيز 0.2% في كل بئر، واترك الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، قم بإزالة الجيلاتين، واشطف الآبار مرتين باستخدام 500 ميكرولتر من الماء المقطر.

الآن، أضف 500 µL من وسط زراعة خلايا F9 RARE-LacZ إلى الآبار. بعد ذلك، التقط مستعمرات خلايا F9 باستخدام طرف ماصة P10 معقم وانقل كل منها إلى بئر واحد. بعد ثلاثة أو أربعة أيام من الزراعة، قم بتقسيم المستعمرات إلى طبقين من أطباق الـ 24 بئراً المغلّفة بالجيلاتين، أحدهما للاختبار والآخر للتوسيع.

بعد يومين إضافيين من الاستزراع، أضف 1 nanomolar من RA إلى كل بئر في لوحة واحدة ذات 24 بئراً واستزرعها طوال الليل. وفي اليوم التالي، قم بإجراء صبغة LacZ لاختبار المستجيبين بدرجة عالية وتوسيع المزرعة المقابلة. وقبل يوم واحد من حصاد أجنة E8.5 أو تفكيك الكرات العصبية، قم بتغطية لوحة ذات 96 بئراً بـ 100 µL من الجيلاتين بتركيز 0.2% لكل بئر، واترك اللوحة لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك، قم بشفط الجيلاتين، واغسل الآبار مرتين باستخدام 200 microliters من الماء المقطر. بعد ذلك، قم بمعالجة خلايا F9 RARE-LacZ المختارة والمحفوظة في أطباق بقطر 10 centimeter باستخدام التريبسين. ثم، قم بزراعة 100, 000 خلية في كل بئر من أطباق 96-well plate باستخدام وسط زراعة خالٍ من G418.

قم بتعبئة عدد كافٍ من الآبار لاستزراع كل جنين بشكل مشترك، أو قم بتجهيز ثلاث آبار لكل نمط جيني في حال العمل مع الكرات العصبية (neurospheres). كما يجب تجهيز 24 بئراً للمنحنى القياسي. بعد ذلك، قم بحضن الطبق لمدة 24 ساعة.

بالنسبة للاستزراع المشترك للخلايا الجنينية، ابدأ بتشريح الأجنة في اليوم E8.5. بعد ذلك، ضع 10 µL من التربسين في أنبوب جديد سعة 1.5 mL، وباستخدام طرف ماصة P20 ذي فتحة واسعة، انقل الجنين كاملاً إلى الأنبوب، وضعه على الثلج. بعد عزل جميع الأجنة، قم بحضن جميع الأنابيب عند 37 °C لمدة خمس دقائق لتفكيك الأنسجة.

بعد مرور خمس دقائق، قم بمزج محتويات كل أنبوب برفق باستخدام طرف ماصة P20، وانقل 10 µL إلى بئر في طبق 96 بئراً المُعد مسبقاً والذي يحتوي على خلايا F9 RARE-LacZ. قم باستزراع الطبق طوال الليل. وبالنسبة للمزارع المشتركة للكرات العصبية، ابدأ بنقل مزرعة الكرات العصبية إلى أنابيب سعة 15 mL.

قم بتدوير الأنابيب بسرعة 200 g لمدة 10 دقائق، وتخلص من جميع السائل الطافي باستثناء واحد ملليلتر. بعد ذلك، قم بتجانس المحتويات باستخدام ماصة P1000. الآن، استخدم حجماً صغيراً لتحديد كثافة الخلايا المفككة.

بعد ذلك، قم بزراعة 100,000 خلية من الخلايا العصبية الكروية المفككة فوق خلايا F9 RARE-LacZ. قم بتعبئة ثلاث آبار من كل نوع من مزارع الخلايا العصبية الكروية. والآن، تأكد من تحضير الآبار الخاصة بمنحنى القياس standard curve.

أضف، في ثلاث مكررات، 100 µL من محاليل all-trans RA التي تم تحضيرها عن طريق التخفيف المتسلسل بسبع تركيزات مختلفة في وسط استزراع F9 RARE-LacZ. قم بتضمين ضوابط سلبية من خلايا غير معالجة. وأخيراً، قم باستزراع لوحة الـ 96 بئراً المعبأة بالكامل طوال الليل.

في اليوم التالي، قم بإزالة الوسط الغذائي وتثبيت المزارع باستخدام 100 µL من الغلوتارالدهيد بتركيز 2.5% لكل بئر. اترك الطبق ليحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. لاحقاً، قم بإزالة المثبت وغسل الآبار مرتين باستخدام 200 µL من PBS لمدة 10 دقائق لكل غسلة.

بعد ذلك، اغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام 200 µL من محلول غسيل LacZ لمدة 10 دقائق لكل غسلة. وخلال الغسلة الثالثة، قم بتحضير محلول صبغ X-gal في أنبوب سعة 15 mL ملفوف بورق القصدير. كما يجب تحضير غرفة ترطيب للوحة ذات 96 بئراً.

الآن، أضف 200 µL من محلول صبغ X-gal إلى كل بئر. ضع الطبق داخل غرفة ترطيب، واحضنه عند 37 °C. بعد فترة الاحتضان، قم بإزالة محلول صبغ LacZ واستبدله بـ 200 µL من PBS.

بعد ذلك، قم بقياس الامتصاصية عند 610 nanometers، وتصوير الطبق. يتكون الخط الخلوي المراسل F9 RARE-LacZ من خلايا سرطانية جنينية ملتصقة تستجيب كمياً لـ RA من خلال تحفيز تناسبي لـ beta-galactosidase. كما تتميز هذه الخلايا بمورفولوجيا ظهارية.

على الرغم من الاستنبات باستخدام اختيار G418، فإن استجابة هذه الخلايا لـ RA ستضعف مع مرور عدة ممرات خلوية. وبناءً على ذلك، فإن عملية الاستنبات الفرعي الدورية ضرورية لضمان وجود مستجيبات قوية وموحدة لـ RA. ومن المتوقع أن تظهر أجنة E8.5 متماثلة الزيجوت للطفرة vl في Gpr161 انخفاضاً في إشارات RA الجنينية. وباستخدام مقايسة الاستنبات المشترك الموصوفة للأجنة المفككة مع خلايا F9 RARE-LacZ، تم تأكيد هذا التوقع.

استُخدم أيضاً الاستزراع المشترك للكرات العصبية المشتقة من البالغين من النوع البري مع خلايا F9 RARE-LacZ لاختبار وجود حمض الريتينويك (RA) في مستنبتات الكرات العصبية. وقد يعود تزايد الصبغ، مقارنة بخلايا المرحلة E8.5، إلى تجانس مستنبتات الكرات العصبية. ومن خلال إنشاء منحنى قياسي لمستويات RA، أصبح من الممكن قياس مستوى RA في مستنبتات الكرات العصبية من النوع البري وفي أجنة المرحلة E8.5.

عند تطبيق هذا الإجراء، تذكر الحفاظ على خلايا F9 RARE-LacZ التي تستجيب بقوة لـ RA من خلال عمليات إعادة الاستنساخ الدورية. كما يجب التأكد من تفكيك العينة جيداً لتسهيل التوزيع المتجانس وقياس RA بشكل متسق. وبعد اتباع هذا الإجراء، يمكن استقصاء آثار الطفرات الجينية على مستويات RA، ومن ثم تنفيذ طرق أخرى للبحث في المكونات المتأثرة بشكل مباشر في مسار إشارات RA.