Micropatterning وجمعية Microvessels 3D

تقدم هذه المخطوطة طريقة حقن صب مهندس microvessels أن ألخص الخصائص الفسيولوجية للالبطانة. العملية المستندة ميكروفلويديك تخلق شبكات الأوعية الدموية براءات الاختراع 3D مع الظروف tailorable، مثل تدفق والتكوين الخلوي، والهندسة، والتدرجات الكيميائية الحيوية. ووصف عملية التصنيع وأمثلة من التطبيقات المحتملة.

الهدف العام من استخدام الأوعية الدقيقة المصممة هندسيا هو تكرار بنية ووظيفة الأوعية الدموية في الجسم لدراسة فسيولوجيا الأوعية الدموية في الحالات الطبيعية والمريضة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الأوعية الدموية مثل كيفية استجابة الخلايا الملعنة المختلفة للتدفق ، وكيف تؤثر على وظيفة الأنسجة ، وكيف تبدأ أمراض الأوعية الدموية وتتطور بمرور الوقت. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تعديلها بسهولة لتقليد أنظمة الأعضاء المختلفة والحالات المرضية.

يمكن القيام بذلك عن طريق تغيير أنواع الخلايا والمصفوفة وتكوين الوسائط والمتغيرات الأخرى. بشكل عام ، قد يكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة قبل أن يدركوا الأخطاء الشائعة التي يمكن أن تؤدي إلى سوء جودة السفن. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية نظرا لوجود العديد من الحيل للتصنيع الناجح أثناء خطوات التشكيل بالحقن والتجميع.

لهذا الإجراء ، قم بإعداد قوالب PDMS المسطحة والمنقوشة الدقيقة وقطع مبيت PMMA مسبقا. يتم توفير وصف لكيفية صنع هذه الأجزاء في بروتوكول النص. قم بتعقيم قوالب PDMS مع البراغي والدبابيس والملقط والملعقة.

لا تقم بتعقيم قطع PMMA. يجب تعقيمها في التبييض تحت غطاء محرك السيارة. بعد السماح لقطع PMMA بالنقع في المبيض لمدة ساعة على الأقل ، اشطف المبيض بالماء المعقم مرتين.

ثم ضع القطع في أطباق معقمة. استنشق الماء الزائد واتركه يجف في الهواء. مع تنظيف كل شيء ، ابدأ البروتوكول عن طريق معالجة الآبار الداخلية لكل من قطع PMMA العلوية والسفلية باستخدام معالج بلازما محمول لمدة دقيقة واحدة تقريبا.

أطفئ الضوء للمساعدة في تصور تغطية العلاج بالبلازما. بعد ذلك ، أضف 1٪ PEI إلى الآبار الداخلية. إذا لم ينتشر PEI بسهولة ، فقم بزيادة وقت العلاج بالبلازما.

بعد ترك PEI يتفاعل لمدة 10 دقائق ، قم بإزالة المحلول ثم اشطف الأجهزة بالماء المعقم واتركها تجف في الهواء. بمجرد التجفيف ، ضع 0.1٪ جلوتارالديهايد على الأسطح المعالجة واترك الجلوتارالديهايد يتفاعل لمدة نصف ساعة. ثم اشطف القطع بالماء المعقم مرتين واتركها تجف في الهواء.

الآن ، قم بإعداد الكولاجين المحايد الطازج بنسبة 0.75٪ لتصنيع الأوعية الدموية من خلال الجمع بين حجم الكولاجين المخصص مسبقا مع محلول تحييد هيدروكسيد الصوديوم المتوسط والصوديوم. قلبي ببطء وحذر باستخدام ملعقة حتى يصبح المحلول متجانسا وبرتقالي اللون. ثم ، إذا لزم الأمر ، أضف الخلايا بالتركيز المطلوب واستمر في تحريك المحلول حتى يتم توزيع الخلايا بشكل موحد.

استعدادا لعملية التجميع ، ضع قالب PDMS المشكل في طبق 100 × 20 ملم وعالج القالب بالبلازما لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك ، قم بمحاذاة قطعة PMMA العلوية على PDMS بحيث تصطف الخزانات المربعة مع خزانات المدخل والمخرج. بعد ذلك ، ضع دبابيس وتد من الفولاذ المقاوم للصدأ في فتحات خزان المدخل والمخرج حتى تظل مفتوحة بعد حقن الكولاجين.

الآن ، قم بتحميل خليط خلايا الكولاجين في حقنة سعة مليلتر واحد دون إدخال فقاعات هواء. ثم باستخدام الملقط ، اضغط برفق على قطعة PMMA العلوية لتثبيتها في قالب PDMS وحقن ببطء حوالي نصف ملليلتر من خليط خلايا الكولاجين في منفذ الحقن. يجب أن يملأ الكولاجين مساحة 20 × 20 ملم فوق النمط ولا يتسرب.

ثم أغلق الطبق بعناية دون تدافع دبابيس وتد. بعد ذلك ، في الجزء السفلي من PMMA ، ضع غطاء زجاجي بحجم 22 ملم مربع في البئر الداخلي. ثم قم بتوزيع حوالي 0.25 مل من الكولاجين بالتساوي على الزجاج.

أكمل النصف السفلي عن طريق خفض PDMS المسطح برفق في الكولاجين بحيث يكون مسطحا ضد PMMA مع عدم وجود فقاعات هواء بينهما. الآن ، ضع نصفي الجهاز بحذر في حاضنة 37 درجة مئوية واترك محلول الكولاجين يتجل لمدة 30 دقيقة قبل المتابعة. بعد التبلور ، أضف ما يكفي من PBS لإحاطة PDMS على القطعة السفلية.

بعد ذلك ، استخدم الملقط لإزالة أي كولاجين زائد حول الحواف وقم بتقشير قطعة PDMS المسطحة ببطء مع الحفاظ على ترطيب الكولاجين باستخدام PBS. لتحضير القطعة العلوية ، استخدم الملقط لرفع مجموعة PMMA و PDMS وقلبها. ثم أضف بضع قطرات من PBS إلى الوجه الداخلي وقم بإزالة قالب PDMS من قطعة PMMA العلوية ، وتقشيرها بسرعة وثبات.

بعد ذلك ، باستخدام زوج ثان من الملقط ، قم بإزالة المسامير برفق من الجانب الآخر من مبيت PMMA. تأكد من خلو المدخل والمخرج من الكولاجين الزائد عن طريق تحريك المسامير لأعلى ولأسفل قبل إزالتها. إذا سقطت المسامير من تلقاء نفسها ، فما عليك سوى استخدام دبوس وتد معقم آخر للتأكد من أن المدخل والمخرج واضحان.

بعد ذلك ، قم بإسقاط المزيد من PBS على الكولاجين المزخرف بصغر ، واقلب القطعة ، وضع البراغي في فتحات الزوايا الأربعة. الآن ، ضع القطعة العلوية برفق على القطعة السفلية لمحاذاة البراغي في ثقوبها. لا تدع القطعتين تنزلقان ضد بعضهما البعض.

بعد ذلك ، قم بربط القطع معا برفق باستخدام ملعقة ولمسة لطيفة حتى لا يتم إحكامها أكثر من اللازم. من الأهمية بمكان أن تكون لطيفا ودقيقا أثناء التجميع. من خلال تطبيق كمية وافرة من PBS ، يتم تقليل الاحتكاك بين الوجه الداخلي.

أثناء تثبيت البراغي ، تابع ببطء وتوقف بمجرد مواجهة أي مقاومة. بعد ذلك ، قم بشفط PBS المحيط بأسطح PMMA وضع قطعة صغيرة من القطن تحت حافة واحدة من الجهاز. ثم استنشق أي PBS من الخزانات.

الآن ، أعد ملء الخزانات بوسط زراعة الخلايا واحتضان الجهاز لمدة ساعة على الأقل للهلام. بمجرد تجميع الجهاز ، استخدم تعليق الخلايا البطانية عند 10 ملايين خلية لكل مليلتر لزرع الجهاز. قم بإزالة الوسيط الموجود في خزانات المدخل والمخرج وباستخدام ماصة 20 ميكرولتر مع أطراف تحميل الهلام، أضف 10 ميكرولتر من تعليق الخلية في وسط خزان المدخل.

سوف تتدفق الخلايا على الفور إلى الشبكة وتغطيها. بمجرد أن تملأ الخلايا الشبكة ويتوازن التدفق ، أضف 150 ميكرولترا من الوسط إلى كلا الخزانين. ثم احتضان الجهاز لمدة ساعة أو أكثر حتى تتمكن الخلايا من الانتشار والالتصاق.

للاستزراع على المدى الطويل ، قم بإزالة الوسيط كل 12 ساعة وأضف 150 ميكرولترا من الوسط الطازج إلى خزان المدخل و 50 ميكرولترا إلى خزان المخرج. بعد 24 ساعة من الزراعة ، يمكن استخدام مضخة حقنة لإنشاء ظروف التدفق المستمر. بعد إحضار المواد إلى الغطاء الحيوي ، قم بإزالة الأنبوب من أكياس الأوتوكلاف وضعه في طبق.

بعد ذلك ، قم بإعداد طبق تدفق معقم عن طريق إذابة الثقوب الجانبية ثم ربط الأنبوب من خلالها. تحضير حقنة سعة 10 مل مع وسط استزراع يحتوي على 3.5٪ ديكستران. بعد ذلك ، قم بتوصيل المحقنة المملوءة بقفل الإغراء في نهاية أنبوب المدخل.

بعد ذلك ، قم بتثبيت المحقنة في المضخة والوسط الغزير حتى تخرج أي فقاعات هواء محاصرة من الأنبوب. بمجرد ملء الأنبوب بوسط وخاليه من الفقاعات ، انقل الجهاز إلى طبق جديد وأدخل مفصل موصل المدخل في مدخل السكن. ثم اضبط مضخة الحقنة على معدل التدفق المطلوب وابدأ الوفرة.

قم بإعداد المخرج عن طريق ملء الأنبوب بوسائط زراعة الخلايا باستخدام إبرة قياس 18 وحقنة سعة مليلتر واحد. لقطه وإزالة الإبرة. بعد ذلك ، قم بإذابة ثقب في غطاء أنبوب تجميع المخرج باستخدام مكواة لحام.

بعد ذلك ، أضف الوسائط إلى أنبوب التجميع ، وأدخل الأنبوب ، وقم بتوصيل مفصل الموصل بمخرج السكن. خلال هذه العملية ، يتم استخدام المشبك للاحتفاظ بالوسط في الأنبوب. بمجرد الانتهاء ، انقل الإعداد بالكامل إلى حاضنة.

اعتمادا على الظروف التجريبية ، قد تحتاج المحقنة إلى إعادة تعبئتها بعد 24 إلى 36 ساعة. أثناء استبدال المحقنة ، تأكد من عدم إدخال الفقاعات في الأنبوب. تم نشر الوريد السري البشري والخلايا الإثيلية من خلال شبكة السوائل الدقيقة المدمجة في الكولاجين لتشكيل تجويف براءات الاختراع وبطانة متقاربة.

تم استخدام العديد من أشكال هندسة السفن لإنشاء ظروف تدفق مختلفة. تم استخدام ظروف ثقافة التدفق المستمر لتطبيق إجهاد قص مستمر على البطانة. كما حافظت الأجهزة التي تم زراعتها في ظل ظروف التدفق المدفوعة بالجاذبية على الجدوى والسالكية على المدى الطويل.

السمة الحاسمة لهذه الأوعية الدقيقة هي قدرتها على الاستجابة للمنبهات الالتهابية. تم التحقيق في ذلك عن طريق إثراء الأوعية الدقيقة بالدم الكامل. تحتوي الأوعية الدقيقة غير المحفزة على بطانة غير منشطة وظلت هادئة.

تم تنشيط الأوعية الدقيقة المحفزة وبدأت استجابتها في تكوين الجلطة. تطبيق آخر مثير للاهتمام للنظام هو دراسة التغيرات المظهرية في الأوعية الدموية المتكونة من مجموعات مختلفة من الخلايا البطانية. على سبيل المثال ، أظهرت الأوعية الدقيقة المتكونة من مجموعات فريدة من الخلايا الجذعية قدرات مختلفة في إنبات الأوعية الدموية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصنيع الأوعية الدقيقة واستخدامها لدراسة بيولوجيا الأوعية الدموية وبناء أنظمة أعضاء نموذجية معقدة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن الممارسة ستتحسن مع معدل تكوين الأوعية الناجحة وتسمح بنتائج أكثر اتساقا. بمجرد إتقانها ، يمكن صنع العديد من الأجهزة في ثلاث إلى أربع ساعات.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل وفرة الدم الكامل أو ديكستران أو العلاجات الصيدلانية لتقييم الهدوء البطاني ، والنفاذية ، والاستجابة للأدوية ، والتشكل العام للخلايا والأوعية.