Name: حديثي الولادة القلب السقالات: مصفوفات رواية للدراسات التجدد (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: اكتشف طريقة إنشاء سقالات قلبية من أنسجة الفئران حديثة الولادة لدراسات التجدد. تتيح هذه التقنية استكشاف تفاعلات الخلايا مع المصفوفة خارج الخلية في علم أمراض القلب التجددي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

يعرب المؤلفون عن تقديرهم للسيدة سينثيا ديكاي لإعداد الأرقام.

<ol><li>Yusen, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Registry+of+the+International+Society+for+Heart+and+Lung+Transplantation%3A+Thirty-second+official+adult+lung+and+heart-lung+transplantation+report--2015%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transplant%22%5BJournal%5D)">Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-second official adult lung and heart-lung transplantation report--2015.</a> J Heart Lung Transplant. 34 (10), 1264-1277 (2015).</li>
<li>Go, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics--2014+update%3A+A+report+from+the+american+heart+association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics--2014 update: A report from the american heart association.</a> Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).</li>
<li>Kapelios, C. J., Nanas, J. N., Malliaras, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogeneic+cardiosphere-derived+cells+for+myocardial+regeneration%3A+current+progress+and+recent+results%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Allogeneic cardiosphere-derived cells for myocardial regeneration: current progress and recent results.</a> Future Cardiol. 12 (1), 87-100 (2016).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion+decellularized+matrix%3A+Using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Perfusion decellularized matrix: Using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).</li>
<li>Porrello, E. R., Olson, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neonatal+blueprint+for+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A neonatal blueprint for cardiac regeneration.</a> Stem Cell Research. 13 (3 Pt B), 556-570 (2014).</li>
<li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+regenerative+potential+of+the+neonatal+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart.</a> Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).</li>
<li>Polizzotti, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuregulin+stimulation+of+cardiomyocyte+regeneration+in+mice+and+human+myocardium+reveals+a+therapeutic+window%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Neuregulin stimulation of cardiomyocyte regeneration in mice and human myocardium reveals a therapeutic window.</a> Sci Transl Med. 7 (281), 281ra45(2015).</li>
<li>Jesty, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-kit%2B+precursors+support+postinfarction+myogenesis+in+the+neonatal%2C+but+not+adult%2C+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (33), 13380-13385 (2012).</li>
<li>Ambrosy, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Global+Health+and+Economic+Burden+of+Hospitalizations+for+Heart+Failure%3A+Lessons+Learned+From+Hospitalized+Heart+Failure+Registries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">The Global Health and Economic Burden of Hospitalizations for Heart Failure: Lessons Learned From Hospitalized Heart Failure Registries.</a> J Am Coll Cardiol. 63 (12), 1123-1133 (2014).</li>
<li>Roger, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Executive+Summary%3A+Heart+Disease+and+Stroke+Statistics-2012+Update+A+Report+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics-2012 Update A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 125 (22), 188-197 (2012).</li>
<li>Kennedy-Lydon, T., Rosenthal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+regeneration%3A+epicardial+mediated+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+B%22%5BJournal%5D)">Cardiac regeneration: epicardial mediated repair.</a> Proc R Soc B. 282 (1821), 2147-2172 (2015).</li>
<li>Williams, C., Sullivan, K., Black, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partially+Digested+Adult+Cardiac+Extracellular+Matrix+Promotes+Cardiomyocyte+Proliferation+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthcare+Mat%22%5BJournal%5D)">Partially Digested Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Cardiomyocyte Proliferation In Vitro.</a> Adv Healthcare Mat. 4 (10), 1545-1554 (2015).</li>
<li>Borg, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+extracellular+matrix+components+by+neonatal+and+adult+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Recognition of extracellular matrix components by neonatal and adult cardiac myocytes.</a> Dev Biol. 104 (1), 86-96 (1984).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immnol%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr Protoc Immnol. 111, A3-B1-3 (2015).</li>
<li>Gilbert, T. W., Freund, J. M., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+DNA+in+biologic+scaffold+materials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Quantification of DNA in biologic scaffold materials.</a> J Surg Res. 152 (1), 135-139 (2009).</li>
<li>Akhyari, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quest+for+an+optimized+protocol+for+whole-heart+decellularization%3A+a+comparison+of+three+popular+and+a+novel+decellularization+technique+and+their+diverse+effects+on+crucial+extracellular+matrix+qualities%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities.</a> Tissue Eng Part C Methods. 17 (9), 915-926 (2011).</li>
<li>Lu, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repopulation+of+decellularized+mouse+heart+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Repopulation of decellularized mouse heart with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular progenitor cells.</a> Nat Commun. 4 (2307), 1-11 (2013).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

اعتماد هذه التقنية على تروية دموية متكررة من القلب يجعل تلافي حدوث الانسداد عنصر حاسم في تحقيق نتائج ناجحة. من القسطرة الأولية للقلب في خطوات 2،2-2،6، إلى التغييرات من حل بين خطوات 2،8-2،14، هناك التلاعب التي يمكن أن تسمح مقدمة من فقاعات الهواء التي حل وسط تدفق سائل الإرواء في عضلة القلب. نظرا لضآلة حجم قلب الأطفال حديثي الولادة، حتى فقاعات دقيقة في الأوعية الدموية يمكن أن يؤدي إلى احتشاء الفني، مما يجعل decellularization غير مكتملة. بالإضافة إلى ذلك، في خطوات غسل لاحقة، يمكن نضح ...

فشل القلب هو شائع وقاتل. وهو مرض التدريجي الذي يؤدي إلى انقباض انخفضت من القلب، الذي يعوق تدفق الدم إلى الأعضاء ويترك مطالب التمثيل الغذائي في الجسم تتم تلبيتها. ويقدر أن 5.7 مليون أميركي يعانون قصور القلب وهذا هو السبب الرئيسي في المستشفى في الولايات المتحدة 9. تكلفة الجماعية لعلاج المرضى في فشل القلب في الولايات المتحدة يتجاوز 300 مليار $ دولار سنويا 9-10. العلاج النهائي الوحيد للفشل نهاية المرحلة القلب هو مثلي زرع القلب. في كل عام، وتشير التقديرات إلى أن هناك حاجة إلى أكثر من 100،000 قلوب المانحة لعمليات زرع القلب في الولايات المتحدة الأمريكية 1-2. ويرجع ذلك إلى عدد محدود من الجهات المانحة، يتم تنفيذ سوى ما يقرب من 2400 عملية زراعة سنويا في الولايات المتحدة (2). بوضوح، يحتاج هذا النقص الجهاز لمعالجتها كما هو مطلوب استراتيجيات أخرى لإنتاج أجهزة إضافية لtransplantaنشوئها، ومن الناحية المثالية، هذه الأجهزة سيكون ذاتي وذلك لتجنب المضاعفات المرتبطة الرفض وكبت المناعة مدى الحياة. العضلية الكبار الثدييات يبرهن على وجود قدرة على التجدد محدودة على الاصابة لكن تشير أدلة حديثة أن قلوب الأطفال حديثي الولادة الثدييات الحفاظ على القدرة على التجدد ملحوظة بعد الاصابة 5-8. على وجه التحديد، وبعد استئصال الجراحي الجزئي، وقد تم اكتشاف نافذة التجديدي بين الولادة وبعد الولادة يوم 7. وتتميز هذه الفترة التجدد بسبب عدم وجود ندبة متليفة، وتشكيل اتساع الأوعية الدموية، وإطلاق سراح من العوامل عائية من النخاب، وcardiomyocyte انتشار 5-8 11. يوفر هذا الإطار التجدد الوقت إمكانية استخدام قلب الأطفال حديثي الولادة كمصدر جديدة من مواد لتطوير قلب bioartificial. ومن المعروف أن المصفوفة خارج الخلية لتقديم العظة هامة لتعزيز cardiomyocytالبريد انتشار والنمو. وقد استكشفت اختلافات واضحة في توافر الجزيئات في المصفوفات حديثي الولادة والبالغين 12 و قدرتها على تشجيع تجديد 13. وقد استخدمت المصفوفات الكبار Decellularized في العديد من الدراسات لتوفير سقالة ECM لإعادة تعمير الخلوي وتوليد قلب bioartificial. في حين أن هذه الدراسات والاكتشافات الجديدة في مجال تكنولوجيا الخلايا الجذعية، تحقق تقدما سريعا، لها عدة عقبات لم تتحقق بعد. على سبيل المثال، القيود في الحفاظ على بنية الأصلي للمصفوفة، والتكامل الخلوي في الجدار مصفوفة، والقدرة على دعم انتشار ونمو كل حد في نجاح هذا النهج. في حين نسبت سمات التجدد متفوقة على قلب الأطفال حديثي الولادة، والجوانب العملية لاستخدام هذه الأنسجة محدودة التنقيب. وبناء على القدرة التجديدية أثبت للقلب الأطفال حديثي الولادة، وقد وضعنا مصفوفات جديدة من خلال تطويرتقنية decellularization للقلب P3 الماوس. وقد تم اختيار قلب P3 لهذه الدراسات كما هو ضمن إطار التجديد القلب كما سبق تحديدها 6 ولكن القلب هو كبير بما يكفي لموسم الحصاد، decellularize وrecellularize. الهدف من هذه الدراسة هو إظهار جدوى إنشاء مصفوفة من قلب فأر حديثي الولادة. توفر دراستنا دليلا على جدوى decellularizing دقيقة واحدة، قلب الأطفال حديثي الولادة مع الحفاظ على السلامة الهيكلية والبروتينية إدارة المحتوى في المؤسسة. علينا أن نبرهن أيضا القدرة على recellularize هذا ECM القلب مع mCherry العضلية التعبير ولقد درست هذه العضلية للتعبير عن مختلف علامات القلب التالية recellularization. ستسمح هذه التقنية لللاختبار تفوق مصفوفة حديثي الولادة لتطوير قلب bioartificial.

<table><tbody><tr><td colspan = "4" ><قوي>1. مواد لعزل قلب الفئران < / قوي ></td></tr> <tr><td>P1 (كما هو موضح ؛ ب 6 ؛ D2-Tg (Myh6 * -mCherry) 2Mik/J)</td> <td>Jackson Laboratories</td><td>21577</td><td>أو ما يعادلها</td></tr><tr><td>60 مم طبق استزراع</td><td>BD Falcon</td><td>353004</td><td>أو ما يعادله</td></tr><tr><td>من محلول ملحي مخزن بالفوسفات درجة الحموضة 7.4 (معقم)</td> <td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td>أو ما يعادله</td></tr><tr><td>شفرة تستخدم مرة واحدة</td><td>Stanley</td><td>28-510</td><td>أو ما يعادلها</td></tr> من <tr><td>المقص القياسي</td><td>Moria Bonn (أدوات العلوم الدقيقة)</td><td>14381-43</td><td>أو ما يعادلها</td></tr><tr><td>مقص زنبركي 10 سم</td><td>أدوات العلوم الدقيقة</td><td>15024-10</td><td>أو ما يعادلها</td></tr> من <tr><td>مقص زنبركي Vannas - 3 مم أدوات</td><td>العلوم الدقيقة</td><td>المتطورة 15000-00</td><td>أو ما يعادلها</td></tr> <tr><td># 5 ملقط</td><td>Dumnot (أدوات العلوم الدقيقة)</td> <td>11295-00</td><td>أو ما يعادلها</td></tr> <tr><td colspan = "4" >2. مواد لإزالة الخلايا < / قوي ></td></tr> <tr><td>مدخل</td><td>محول Chemglass</td><td>CG-1013</td><td>قابل للتعقيم</td></tr><tr><td>Septum</td><td>Chemglass</td><td>CG-3022-99</td><td>قابل للتعقيم</td></tr><tr><td>1/8 بوصة. معرف × 3/8 OD C-Flex الأنابيب</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06422-10</td><td>قابل للتعقيم</td></tr><tr><td>ذكر لوير إلى 1/8 "خرطوم شائكة</td><td>محول McMaster-Carr</td><td>51525K33</td><td>قابل للتعقيم</td></tr><tr><td>أنثى لوير إلى 1/8 "خرطوم</td> شوكة <td>محول McMaster-Carr</td><td>51525K26</td><td>Prolene</td></tr><tr><td>7-0 خياطة جراحية &nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>8648G</td><td>أو ما يعادله</td></tr><tr><td>من حامل الحلقة</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47807</td><td>أو ما يعادله</td></tr><tr><td>Clamp</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-769-6Q</td><td>أو ما يعادله</td></tr><tr><td>حامل المشبك</td><td>العادي Fisher Scientific</td><td>05-754Q</td><td>أو ما يعادله</td></tr><tr><td>60 سم مكعب برميل حقنة &nbsp ؛</td><td>Coviden</td><td>1186000777T</td><td>أو ما يعادله</td></tr><tr><td>من دورق</td><td>Kimble</td><td></td><td>14000250 أو ما يعادله</td></tr><tr><td>22 جم × 1 إبرة حقنة</td><td>BD</td><td></td><td>305155 أو ما يعادلها</td></tr><tr><td>12 سم مكعب حقنة</td><td>Coviden</td><td>8881512878</td><td>أو ما يعادلها</td></tr><tr><td>من 3 اتجاهات توقف الديك</td><td>سميث ميديكال</td><td>MX5311L</td><td>أو ما يعادلها</td></tr><tr><td>من أنابيب PE50</td><td>BD كلاي آدامز إنترميديك</td><td>427411</td><td>يجب أن تكون قابلة للتشكيل بالحرارة. يوصى باستخدام البولي إيثيلين.</td></tr><tr><td>يوصى باستخدام 1٪ SDS</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td>درجة فائقة النقاء. اصنع محلولا جديدا وقم بتعقيمه قبل الاستخدام.</td></tr><tr><td>1٪ Triton X-100 &nbsp ؛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>اصنع محلولا جديدا من مخزون 10٪ وقم بتعقيمه قبل الاستخدام.</td></tr><tr><td>معقم dH 2O</td><td>Hyclone</td><td>SH30538.02</td><td>أو نظام MilliQ نقية المياه.</td></tr><tr><td>1x قلم / بكتيريا</td><td>Corning CellGro</td><td>30-001-Cl</td><td>أو ما يعادلها &nbsp;</td></tr><tr><td colspan = "4" ><قوي>3. مواد لتقدير كمية الحمض النووي < / قوي ></td></tr> <tr><td>البروتيناز K</td><td>فيشر</td><td>BP1700</td><td>>30 نشاط U / mg</td></tr><tr><td>KCl</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>P9333</td><td>أو ما يعادلها</td></tr><tr><td>MgCl2&# 183 ؛ 6H2O</td><td>Mallinckrodt</td><td>5958-04</td><td>أو ما يعادلها</td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>أو ما يعادله</td></tr><tr><td>من قاعدة تريس / هيدروكلوريد</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503 / T5941</td><td>أو ما يعادلها</td></tr><tr><td>من طقم فحص Pico-Green dsDNA</td><td>Life Technologies &nbsp ؛</td><td>يتطلب P7589</td><td>مقياس الفلور لقراءة</td></tr><tr><td colspan = "4" >4. طريقة تثبيت وتقسيم الأنسجة < / قوية ></td></tr> <tr><td>بارافورمالدهايد</td><td>سيجما-ألدريتش</td><td>P6148</td><td>أو ما يعادلها</td></tr><tr><td>من الجيلاتين من النوع A من جلد الخنازير</td><td>يجب أن يكون Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td><td>300 إزهار أو أكبر</td></tr> <tr>< td colspan = "4" >5. طريقة لأنسجة الأنسجة< / قوي></td></tr> <tr><td>قوالب التبريد 10 × 10 × 5 مم</td><td>Tissue-Tek</td><td>4565</td><td>أو ما يعادلها</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Hacker / Bright</td><td>Model OTF</td><td>أو ما يعادلها</td></tr><tr><td>من شرائح المجهر&nbsp; 25 × 75 × 1 مم</td><td>فيشر Scientific</td><td>12-550-19</td><td>أو ما يعادلها</td></tr><tr><td>Hematoxylin 560 &nbsp ؛</td><td>Surgipath/Leica Selectech&nbsp;</td><td>3801570</td><td>أو ما يعادلها</td></tr><tr><td>من مختبرات</td><td>الإيثانول</td> ديكون <td>2701</td><td>أو ما يعادلها</td></tr><tr><td>Define</td><td>Surgipath/Leica Selectech&nbsp;</td><td>3803590</td><td>أو ما يعادله</td></tr><tr><td>Blue buffer&nbsp;</td><td>Surgipath/Leica Selectech&nbsp;</td><td>3802915</td><td>أو ما يعادله</td></tr><tr><td>Eosin الكحولي Y 515 &nbsp ؛</td><td>Surgipath/Leica Selectech&nbsp;</td><td>3801615</td><td>أو ما يعادلها</td></tr><tr><td>من بديل الزيلين 83 للفورمولا &nbsp;</td><td>CBG Biotech&nbsp;</td><td>CH0104B</td><td>أو ما يعادلها</td></tr><tr><td>Permount Mounting Medium&nbsp;</td><td>فيشر للكيماويات&nbsp;</td><td>SP15-500</td><td>أو ما يعادله</td></tr><tr><td>من الكولاجين الرابع الأجسام المضادة</td><td>Rockland</td><td>600-401-106.1</td><td>أو ما يعادلها</td></tr> <tr><td>من ألفا ؛ الأكتينين الأجسام المضادة</td><td>Abcam</td><td>AB9465</td><td>أو ما يعادلها</td></tr><tr><td>من mCherry Antibody</td><td>Abcam</td><td>AB205402</td><td>أو ما يعادلها</td></tr><tr><td>NKX2.5 الأجسام المضادة</td><td>سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية</td><td>SC-8697</td><td>أو ما يعادلها</td></tr><tr><td>من الحمار المضاد للفأر AF488 تقنية حياة الأجسام</td><td></td><td>المضادة A21202</td><td>أو ما يعادلها</td></tr><tr><td>من الحمار المضاد للدجاج AF594 الأجسام المضادة</td><td>جاكسون للبحوث المناعية</td><td>703-585-155&nbsp;</td><td>أو ما يعادلها</td></tr><tr><td>الحمار المضاد للماعز CY5 الأجسام المضادة</td><td>Jackson Immunoresearch&nbsp;</td><td>705-175-147</td><td>أو ما يعادله</td></tr><tr><td>من Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H + L) AF594</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-587-003</td><td>أو ما يعادله</td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade Mountant مع DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>P36930</td><td>أو ما يعادله</td></tr> <tr><td colspan = "4" >6. عزل خلايا عضلة القلب البطينية لحديثي الولادة باستخدام الطلاء المسبق < / قوي ></td></tr><tr><td>HBSS (Ca ، خال من المغنيس)</td> <td>Hyclone</td><td>SH30031.02</td><td>أو ما يعادله</td></tr><tr><td>HEPES (1 M) Corning</td> <td>CellGro</td><td>25-060-Cl</td><td>أو مصفاة الخلايا المكافئة</td></tr><tr><td></td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>أو ما يعادلها</td></tr><tr><td>50 مل أنبوب</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>أو ما يعادله</td></tr><tr><td>Primeria 100 مم لوحات Corning</td><td></td><td>353803</td><td>Primeria سطح يعزز ارتباط الخلايا الليفية وتعزيز نقاء أعلى للخلايا</td></tr><tr><td>العضلية التربسين</td><td>Difco</td><td>215240</td><td>أو ما يعادلها</td></tr><tr><td>DNase II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8764</td><td>أو ما يعادلها</td></tr><tr><td>DMEM (الحد الأدنى من الوسائط الأساسية من Delbecco)</td> <td>Hyclone</td><td>SH30022.01</td><td>أو ما يعادلها</td></tr><tr><td>فيتامين B12 & nbsp ؛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V6629</td><td>أو ما يعادلها</td></tr><tr><td>من ألواح الطلاء ب Fibronectin &nbsp ؛</td><td>BD Bioscience</td><td>354501</td><td>أو ما يعادله</td></tr><tr><td>مصل الأبقار الجنينية&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03</td><td>أو ما يعادلها</td></tr><tr><td>الأواني الزجاجية للمفاعل الحيوي للقلب</td><td>Radnoti Glass Technology</td><td>120101BEZ</td><td>يجب أن تكون قابلة للتعقيم عن طريق التعقيم أو الغاز.</td></tr></tbody></table>

حديثي الولادة القلب السقالات: مصفوفات رواية للدراسات التجدد

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

العلاج النهائي الوحيد لفشل القلب في المرحلة النهائية هو زراعة القلب التقويمية. في كل عام ، تشير التقديرات إلى أن هناك حاجة إلى أكثر من 100,000 قلب متبرع لإجراءات زراعة القلب في الولايات المتحدة1-2. نظرا للأعداد المحدودة للمتبرعين ، يتم إجراء ما يقرب من 2,400 عملية زرع فقط كل عام في الولايات المتحدة2. تم تنفيذ العديد من الأساليب ، من دراسات العلاج الخلوي إلى زرع أجهزة المساعدة الميكانيكية ، إما بمفردها أو مجتمعة ، في محاولة لإقناع القلب بإصلاح نفسه أو إراحة القلبالفاشل 3. على الرغم من هذه الجهود ، لا تزال أجهزة المساعدة البطينية تستخدم إلى حد كبير لغرض سد الزرع ، ولا تزال فائدة العلاجات الخلوية ، على الرغم من أنها تحمل بعض الوعود العلاجية ، تقتصر على التجارب السريرية. بالإضافة إلى ذلك ، تمت محاولة زرع الأعضاء الأجنبية مباشرة ولكن النجاح كان محدودا بسبب الرفض المناعي. من الواضح أن هناك حاجة إلى استراتيجية أخرى لإنتاج أعضاء إضافية للزرع ، ومن الناحية المثالية ، ستكون هذه الأعضاء ذاتية المنشأ لتجنب المضاعفات المرتبطة بالرفض وتثبيط المناعة مدى الحياة. إزالة الخلايا هي عملية إزالة الخلايا المقيمة من الأنسجة لفضح المصفوفة الأصلية خارج الخلية (ECM) أو السقالة. يوفر نزع الخلايا بالتروية الحفاظ الكامل على البنية ثلاثية الأبعاد للأنسجة ، مع ترك الجزء الأكبر من الخصائص الميكانيكية للأنسجةسليمة 4. يمكن استخدام هذه السقالات لإعادة توطين الخلايا السليمة لتوليد نماذج بحثية ، وربما الأعضاء التي تشتد الحاجة إليها للزرع. لقد عرضنا السقالات من الفئران حديثي الولادة (P3) ، المعروفة بالاحتفاظ بقدرات رائعة على تجديد القلب ، 5-8 لإزالة الخلايا بوساطة المنظفات وأعدنا ملء هذه السقالات بخلايا قلب الفئران. تدعم هذه الدراسات جدوى هندسة بنية قلب حديثي الولادة. كما أنها تسمح بالتحقيق فيما إذا كانت ECM لقلوب ما بعد الولادة المبكرة قد تحتوي على إشارات من شأنها أن تؤدي إلى تحسين استراتيجيات إعادة الخلية.

<html> Decellularization في المتوسط، والوقت لdecellularization من قلب P3 باستخدام هذا البروتوكول ما يقرب من 14 ساعة. يعطى متوسط ​​وزن القلب من 23 ملغ لحديثي الولادة P3. Acellularity يوضح الشكل 3A قلب الأطفال حديثي الولادة P3 سليمة تماما (كامل جبل). ويوضح الشكل 3B نفس ا...

في هذه الدراسات، ونحن نقدم منهجية للرواية، حديثي الولادة، السقالات القلب الفئران للاستخدام في الدراسات التجدد.

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

الهدف العام من هذه المنهجية هو توليد سقالات جديدة من أنسجة قلب أجنة الميريان لغرض استخدامها في دراسات التجديد. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في طب القلب التجديدي، كما توفر نموذجاً جديداً لدراسة التفاعلات بين الخلايا والمصفوفة، حيث أن المصفوفة خارج الخلوية مشتقة من أنسجة قلبية قادرة على التكاثر.تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تتيح اكتشاف المستجدات في المصفوفة خارج الخلوية لحديثي الولادة. سيقوم ستيفان كرين، الفني في مختبري، باستعراض هذا الإجراء. قبل البدء في الإجراء، قم بتسخين جزء بطول 4 cm من أنبوب PE 50 فوق لهب كحولي صغير لإنشاء قسطرة أصغر وأكثر دقة.قُم بقص الأطراف للأبعاد المناسبة للحصول على قسطرتين متماثلتين من كل جانب من الـ PO، ثم ضع طرف الأنبوب المقطوع لفترة وجيزة في اللهب لصهر شفة واحدة على الفتحة الموجودة عند الطرف الرفيع. بعد ذلك، املأ محقنة سعة 12 milliliter بمحلول PBS وثبّت صنبور إيقاف ثلاثي الاتجاهات على المحقنة. صِل إبرة قياس 22 gauge بالصنبور وادفع الإبرة عبر الحاجز.بعد ذلك، قم بتمرير قسطرة أنابيب PE فوق الإبرة وقم بغسل المجموعة باستخدام PBS. وعندما تصبح مجموعة القسطرة جاهزة، امسح صدر المولود الجديد بـ 70% ethanol. ثم استخدم مقصاً قياسياً لقص الجلد بعيداً عن الصدر، مع سحب الأنسجة جانبياً باستخدام ملقط رقم خمسة.بعد ذلك، قم بثقب جدار البطن أسفل عظم القص مباشرة وأمسك بالنتوء الخنجري باستخدام الملقط. اسحب عظم القص نحو الجهة الرأسية بعيداً عن الجسم أثناء القطع عبر الأضلاع على جانبي الصدر، ثم اقلب القفص الصدري نحو الأعلى. عندما يصبح القلب مرئياً، اسحب الغدة الزعترية جانبياً لتشريح الفصين الرئيسيين، مما يكشف عن قوس الأبهر والأوردة الجوفاء والرئوية.باستخدام مقصات زنبركية بطول 10 centimeter، اقطع الشرايين الرئيسية المنبثقة من قوس الأبهر، وكذلك الشريان الأبهر نفسه. أمسك بنهايات الأوعية المقطوعة لقلب القلب نحو الأمام، وفصله عن الرغامي والمريء، ثم اقطع ما بين الرئتين والقلب وعلى جانبي القلب لقطع الأوعية الدموية الرئوية والأوردة الرئيسية الأخرى. بعد ذلك، أمسك بالنهايات المقطوعة للأوعية الرئيسية وأخرج القلب من المنصف، ثم ضع القلب في طبق زراعة بقطر 60 millimeter يحتوي على PBS معقم.لإزالة الخلايا من القلب، ضع طبق الزرع تحت مجهر تشريحي وأدخل إبرة مجموعة القسطرة في الشريان الأورطي وصولاً إلى الصمام الأورطي، دون تجاوزه. ثبّت الإبرة بربطة واحدة من خيط جراحي 7-0، مع وضع جناح القسطرة قريبًا من الربطة لضمان إحكام الغلق، ثم قم بتروية القلب بلطف باستخدام PBS. في حال عدم وجود تسريبات، سينبض النسيج باللون الأبيض بشكل متجانس مع إزالة الدم الكامن.ضع السدادة المطاطية في عنق محول الإدخال واثنِ جوانب السدادة فوق الزجاج. بعد ذلك، قم بتوصيل خزان مملوء بـ 60 milliliters من 1%Sodium dodecyl sulfate في ماء مقطر عبر أنبوب بطول كافٍ لتشكيل عمود يولد ضغطاً قدره 20 millimeters of mercury، وقم بتروية القلب بمحلول SDS لمدة 14 hours. في نهاية عملية التروية، سيصبح القلب شفافاً مع عدم وجود أنسجة متبقية ملحوظة.قم بغسل النظام وصولاً إلى الصمام بـ SDS المتبقي، ثم املأ الخزان بـ 10 milliliters من الماء منزوع الأيونات. بعد ذلك، قم بغسل القلب بتعاقب عمليات تروية باستخدام 10 milliliters من Triton X-100 بتركيز 1%، و10 milliliters من الماء منزوع الأيونات، و60 milliliters من PBS المحتوي على البنسلين والستريبتومايسين. بعد عملية التروية الأخيرة، يُحفظ القلب في PBS والمضادات الحيوية عند درجة حرارة أربع degrees Celsius.لإعادة استزراع الأنسجة، انقل مصفوفة القلب الموصلة بالقسطرة إلى طبق زراعة بقطر 60 millimeter تحت مجهر تشريحي، وقم بتوصيل محقنة سعة one milliliter مزودة بإبرة مقاس 22 gauge ومحملة بالخلايا المطلوبة إلى القسطرة. تحقق من خلو المجموعة من الفقاعات، ثم قم بتروية 20 µL من معلق الخلايا في الدقيقة داخل مصفوفة القلب عبر الشرايين التاجية بلطف. عند توصيل 100 µL من الخلايا، افصل المحقنة وادفع القسطرة في وصلة صماء مقاس 22 gauge مثبتة في وصلة الجذب الموجودة في الجانب السفلي من غطاء وعاء القلب في المفاعل الحيوي.الآن، ابدأ بتشغيل المضخة 연دوية (peristaltic pump) وتأكد من أن التدفق ينتقل من الخزان عبر المضخة ومن خلال مصيدة الفقاعات إلى القسطرة، وأن الدورة القلبية تتدفق خارج الأوردة وتقطر من القمة، لتعود مرة أخرى إلى خزان الوسط. تظهر هذه الصور صبغ الهيماتوكسيلين والإيوسين لقلوب سليمة وأخرى منزوعة الخلايا. لاحظ غياب النوى الإيجابية لصبغة الهيماتوكسيلين وتناقص البنى الإيوسينية في القلب المنزوع الخلايا.لتقييم محتوى المصفوفة خارج الخلية لحديثي الولادة في القلوب السليمة والمنزوعة الخلايا لحديثي الولادة، يُظهر التلوين المناعي أن الكولاجين IV يتم التعبير عنه بقوة في كل من القلب السليم والمنزوع الخلايا، وأن تموضع هذا البروتين يتم الحفاظ عليه بعد إزالة الخلايا، بينما تتم إزالة النوى الموجبة لـ DAPI بشكل فعال. كما ينخفض محتوى DNA في قلوب حديثي الولادة بعد عملية نزع الخلايا القائمة على المنظفات، وهو ما يتفق مع التقارير التي استخدمت نزع الخلايا القائم على المنظفات في أنسجة أخرى. ويمكن ملاحظة الخلايا العضلية القلبية المعاد استزراعها التي هاجرت إلى جدار البطين الأيسر في هذه الصور.بعد مرور ما يصل إلى 23 يوماً من التروية، قد تكون هذه الخلايا المهاجرة إيجابية لعلامات الخلايا القلبية السلفية، أو mCherry، أو علامات الخلايا العضلية القلبية المتمايزة، أو DAPI، مع تعبير غالبية الخلايا عن العلامات الأربعة جميعها. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في غضون 34 ساعة إذا نُفذت بشكل صحيح. وأثناء محاولة إجراء هذا الإجراء، من المهم تذكر الحرص على عدم التسبب في انصمام القلب عن طريق إدخال الهواء عبر جهاز التروية.بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن استخدام إنتاج الهلام والطباعة ثلاثية الأبعاد لإنشاء طعوم تكاثرية أو حتى قلوب ثلاثية الأبعاد في المختبر. ويمكن لهذه التقنية أن تمهد الطريق للباحثين لتعزيز تجديد عضلة القلب. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إزالة الخلايا وإعادة استزراع الخلايا في قلب فأر حديث الولادة.لا تنسَ أن العمل مع Sodium dodecyl sulfate قد يكون خطيراً، لذا يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة مثل ارتداء قناع N-95 أو استخدام خزانة استخلاص الغازات عند التعامل مع الكاشف في صورته المسحوقة الجافة.

neonatal-cardiac-scaffolds-novel-matrices-for-regenerative-studies

Research

JoVE Journal

Bioengineering

الهندسة الحيوية

طرق لإعداد جيل من مصفوفة حقن الأنسجة decellularized وحقنه في الفئران عضلة...

تصنيع مواد حقن المشتقة بيولوجيا للهندسة الأنسجة عضلة القلب

في هذا البروتوكول ، نوضح تصنيع طبقات أساسية لثقافة خلايا القلب المقلدة الحيوية المصنوعة من مادتين بوليمريتين متميزتين باستخدام الطباعة الحجرية للقوة الشعرية.  توفر الطرق الموصوفة تقنية قابلة للتطوير وفعالة من حيث التكلفة لهندسة بنية ووظيفة أنسجة القلب العيانية للتطبيقات في المختبر وفي الجسم الحي.

الشعرية قوة الطباعة الحجرية لهندسة الأنسجة القلبية

لإنشاء هياكل عالية التنظيم من الأنسجة المعقدة ، يجب على المرء تجميع أنواع متعددة من المواد والخلايا في مركب متكامل.  يشتمل هذا التصميم الاندماجي على صفائح خلايا ذات طبقات خاصة بالأعضاء مع مادتين متميزتين مشتقتين بيولوجيا تحتويان على قاعدة مصفوفة ليفية قوية ، وخلايا بطانية لتعزيز تكوين أوعية جديدة.

هندسة الأنسجة: بناء ومتعددة الخلايا 3D سقالة لتسليم الطبقات صفائح خلية

يصف هذا البروتوكول نموذجا قابلا للتكرار بدرجة كبيرة لتجديد القلب عن طريق التحريض الجراحي لاحتشاء عضلة القلب في البطين الأيسر لفئران اليوم الأول بعد الولادة. تتضمن الطريقة تحريض التخدير المنخفض للحرارة وربط الشريان التاجي الأمامي الأيسر الهابط.

احتشاء عضلة القلب في الفئران حديثي الولادة، نموذج للتجديد القلب

ويصف هذا البروتوكول ديسيلولاريزيشن الكامل لعضلة القلب البشري مع الحفاظ على عناصر المصفوفة خارج الخلية. الاستمرار في معالجة نتائج المصفوفة خارج الخلية في إنتاج المجهرية الدقيقة والمائية تجميع ذاتي سيتوبروتيكتيفي.

التجهيز لانسجة القلب البشري تجاه المصفوفة خارج الخلية التي ذاتية تجميع المائية في المختبر و في فيفو التطبيقات

المصفوفة خارج الخلية القلبية (ECM) هو شبكة معقدة من الجزيئات التي تنسق العمليات الرئيسية في الأنسجة والأعضاء بينما دائم يعيد البناء الفسيولوجية طوال الحياة. رخص ديسيلولاريزيشن موحدة من قلوب الأجنة والبالغين الدراسات التجريبية المقارنة لكل الأنسجة في سياق 3D التقاط خصائص النشاط الحيوي والهندسة المعمارية الأصلية.

ديسيلولاريزيشن مماثلة لانسجة القلب الجنين والكبار Explants كمثل 3D منهاجي في المختبر الدراسات

هذا البروتوكول وصف أسلوب المستندة إلى القالب صافي لإنشاء أنسجة القلب خالية من السقالة ثلاثية الأبعاد مع السلامة الهيكلية مرضية وسلوك الضرب متزامن.

أسلوب صافي المستندة إلى القالب لإنشاء أنسجة القلب خالية من السقالة ثلاثي الأبعاد

يمكن استخدام ديسيلولاريزيد السقالات المستمدة من الغضروف سقالة لإصلاح الغضروف دليل وكوسيلة لتجديد الأنسجة أوستيوتشوندرال. هذا الكتاب يصف عملية ديسيلولاريزيشن بالتفصيل ويوفر اقتراحات لاستخدام هذه السقالات في الإعدادات في المختبر.

تصنيع السقالات مصفوفة ديسيلولاريزيد المستمدة من الغضروف

تظهر هنا مجموعة من البروتوكولات لتوليد وحفظ كرويات القلب (CSs) من الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان والمستزرعة في شكل متعدد الأبعاد عالي الإنتاجية. يعمل هذا النموذج ثلاثي الأبعاد كمنصة قوية لنمذجة الأمراض ، والفحوصات عالية الإنتاجية ، ويحافظ على وظائفه بعد الحفظ بالتبريد.

توليد ، فحص عالي الإنتاجية ، وبنوك حيوية للكرويات القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان

يقدم هذا العمل نموذجا حيوانيا للتليف الناجم عن الانتقال البطاني إلى اللحمة المتوسطة ، كما يظهر في عيوب القلب الخلقية مثل تضيق الأبهر الحرج أو متلازمة القلب الأيسر الناقص التنسج ، مما يسمح بإجراء تقييم مفصل للأنسجة النسيجية ، وتحديد مسارات الإشارات التنظيمية ، واختبار خيارات العلاج.

نموذج زراعة قلب الفئران غير المتجانسة لحديثي الولادة لدراسة الانتقال البطاني إلى اللحمة المتوسطة

تم استزراع الخلايا الليفية المعزولة من قلب الإنسان البالغ لتلتقي على الأطباق المغلفة بالجيلاتين لإنتاج مصفوفة خارج الخلية خاصة بعضلة القلب. بعد إزالة الخلايا ، يمكن استخدام هذه الركيزة لزراعة ودراسة الخلايا القلبية الأخرى وتفاعلات مصفوفة الخلايا.

إنتاج مصفوفة القلب خارج الخلية من الخلايا الليفية البشرية البالغة لطلاء طبق الثقافة

اكتشف طريقة إنشاء سقالات قلبية من أنسجة الفئران حديثة الولادة لدراسات التجدد. تتيح هذه التقنية استكشاف تفاعلات الخلايا مع المصفوفة خارج الخلية في علم أمراض القلب التجددي.

حديثي الولادة القلب السقالات: مصفوفات رواية للدراسات التجدد

استكشف المزيد من الفيديوهات