المتعدد الوسائط الكمي المرحلة التصوير مع الرقمي المجسم المجهر يقيم بدقة شفاء المعوية والتهاب الجرح طلائي

الهدف العام من هذه الدراسة هو استخدام الفحص المجهري الثلاثي الأبعاد الرقمي أو DHM لتوفير تصوير تباين كمي آلي خال من البقع لعينات أنسجة القولون الالتهابية المعوية للتقييم متعدد الوسائط لالتئام الجروح الظهارية في المختبر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التهاب الجهاز الهضمي والتئام الجروح حول نشاط المرض الملتهب البشري والبحري الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح باكتشاف الخلايا والأنسجة وقياسها من خلال المعلمات الفيزيائية بطريقة موضوعية وخالية من البقع. سيوضح الإجراءات Fittest Ketelhut ، وهو فني ، من مركز التكنولوجيا الطبية الحيوية.

قم بإعداد مزرعة الخلايا ، واحتضان أربع مرات عشرة إلى الخامس ، وخليتان كاكو لكل سنتيمتر مربع في أطباق بتري 35 ملم مجهزة بإدخالات ثقافة عالية في وسط RPMI مكملة ب FBS والمضادات الحيوية عند 37 درجة مئوية في 95٪ رطوبة وخمسة بالمائة ثاني أكسيد الكربون. بعد يومين ، عالج الخلايا بالعامل المعني وأعد الثقافات إلى الحاضنة لمدة 24 ساعة إضافية. في اليوم التالي ، استنشق المادة الطافية واستخدم الملقط لإزالة الإدخالات.

اغسل المزرعة مرة إلى مرتين باستخدام مليلتر واحد من الوسط المزروع بالخلايا المخزنة HEPES لإزالة أي خلايا ميتة وأي مكونات خلوية متبقية من منطقة الجرح. ثم أضف ملليلترين من الوسط المخزن HEPES الطازج وأغلق الطبق. الآن ضع طبق بتري في المجهر الرقمي الثلاثي الأبعاد وحدد الهدف 10 ×.

افتح برنامج الحصول على الصور وحدد وضع تصوير المجال الساطع. اضبط غرفة التسخين على 37 درجة مئوية وضع المزرعة في غرفة التسخين. بعد ذلك ، حرك مجال العرض حتى يمكن تصور جرح مناسب بطبقة خلية عملاقة واحدة وحدود مستقيمة على كلا الجانبين بدون خلايا ميتة أو مصل في نافذة المراقبة الحية.

التقط صورة ضوئية بيضاء لمنطقة الجرح الأولية. ثم قم بتشغيل إضاءة الضوء الأبيض وحدد وضع الفحص المجهري الرقمي الثلاثي الأبعاد. قم بتشغيل إضاءة الليزر وحدد وقت تعريض ضوئي أقل من ثلاثة مللي ثانية لتسجيل الهولوغرام.

إذا ظهرت أطراف التداخل خارج الوصول الثلاثية الأبعاد مع تباين مناسب ، فقم بالتقاط عينة ثلاثية الأبعاد وإعادة بناء صورة طور كمية باستخدام برنامج إعادة البناء للتحقق من جودة الصورة. بعد ذلك ، ابدأ مراقبة DHM المنقضية زمنيا للجرح الذي يوقف التسجيل عند نقطة النهاية المناسبة واحصل على صورة نهائية للعينة تحت إضاءة الضوء الأبيض. بالنسبة لكبريتات الصوديوم الحادة من ديكستران ، أو تحريض التهاب القولون DSS ، قم بتوفير ثلاثة جرامات من DSS المذاب في 100 مل من الماء المعقم للفئران ablibidim.

بعد سبعة أيام ، احصل على سبعة أجزاء بسمك سبعة ميكرومتر من عينات القولون السويسري المدرفلة من الضابطة والمعالجة. اغمر كل قسم في 50 إلى 100 لتر ميكرو من PBS وقم بتغطية العينات بزلات غطاء زجاجي فردية. تأكد من أن قيعان الشرائح خالية من الغبار والتلوث الآخر.

بعد ذلك ، ضع الشريحة الأولى على مرحلة المجهر واضبط مجال الرؤية حتى تصبح منطقة الأنسجة محل اهتمامها مرئية. اجعل العينة في تركيز بؤري حاد والتقط صورة مجال ساطعة في برنامج الحصول على الصور. ثم حدد وضع التصوير DHM وانتقل إلى إضاءة ضوء الليزر.

قم بتعيين وقت تعريض ضوئي أقل من ثلاثة مللي ثانية وتأكد من ظهور هوامش تداخل الوصول المجسم مع تباين مناسب في نافذة التصوير المباشر. ثم التقط صورة ثلاثية الأبعاد رقمية للأنسجة. من الناحية الداخلية ، تشمل الأدلة على التهاب القولون المعتدل إلى الشديد سماكة جدار القولون ، وتغيرات في نمط الأوعية الدموية ، وإعادة تركيب الألياف ، وحبيبات سطح الغشاء المخاطي.

يكشف التقييم النسيجي التقليدي لأقسام القولون عن وذمة ملحوظة في جدار القولون ل DSS المعالجة مقابل الضابطة الموجودة في الغالب في تحت الغشاء المخاطي. توضح أيضا صور تباين مرحلة DHM الكمية المقابلة وخرائط معامل الانكسار ذات الصلة أن هذه التغيرات في الأنسجة مع عدم وجود اختلافات واضحة في كثافة الوحش الظهاري واضحة بشكل خاص في عينات الأنسجة الأصلية غير الملوثة. ينخفض معامل الانكسار بشكل كبير في الظهارة وتحت الغشاء المخاطي والسدى للفئران المصابة بالقولون مقارنة بالضوابط السليمة مع وجود علاقة ذات دلالة إحصائية بين الفقدان النسبي لوزن الجسم ومعامل الانكسار في التجارب.

هنا يتم عرض المراقبة المستمرة التمثيلية لمقايسة التئام الجروح بواسطة الفحص المجهري المجسم الرقمي على مدار 45 ساعة. السماح بحسابات مساحة السطح المغطاة بالخلية ، ومتوسط سمك الخلية ، والكتلة الجافة الخلوية على مدار عملية الشفاء. لقد أظهرنا أن DHM يسمح بالمراقبة المستمرة لالتئام الجروح الظهارية مع توفير المعلومات الأساسية الحيوية حول تغيرات الخلايا التي يسببها السيتوكين.

علاوة على ذلك ، نوضح التقييم الدقيق للضرر النسيجي في نماذج التهاب القولون وعينات أنسجة القولون البشري بواسطة DHM من خلال قياس تغيرات معامل الانكسار. نظرا لأن DHM يعتمد على الكشف عن تأخير أطوال المسار البصري ، يمكن تحليل المعلمات الفيزيائية الحيوية المطلقة ، مثل كثافة الأنسجة أو الكتلة الجافة أو السماكة الخلوية ، عن طريق تصوير تباين الطور الكمي الخالي من البقع. إن تتويج DHM بمجاهر البحث الشائعة ومتانة التقنية يمهد الطريق للتطبيقات الروتينية لهذه الطريقة في بيولوجيا الخلية وعلم الأمراض الرقمي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام الفحص المجهري الثلاثي الأبعاد الرقمي لتحليل أنسجة مزارع الخلايا الحية في بيئة المختبرات الطبية الحيوية. في الختام ، ينشئ DHM أداة قيمة وجديدة وكمية لتقييم المعلمات المطلقة للالتهاب ، بالإضافة إلى القياس الكمي المبسط للإطاعية الظهارية في المختبر مع إمكانات عالية للاستخدام التشخيصي الانتقالي.