تشكيل الضوء بوساطة والزخرفة من الهلاميات المائية للتطبيقات خلية ثقافة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تكوين الخلايا ونمطها وتغليفها داخل مصفوفات خلوية إضافية قائمة على البوليمر الاصطناعي. يمكن استخدام هذه الطريقة لمعالجة الأسئلة البيولوجية الحرجة المتعلقة بتحديد الإشارات الخلوية الإضافية التي تنظم استجابات الخلايا داخل بيئات دقيقة غير متجانسة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يتم إنشاء مصفوفة اصطناعية قوية لتغليف الخلايا وثقافتها باستخدام البروتوكولات والمواد التي يمكن الوصول إليها.

يمكن استخدام هذه الطريقة لزراعة الخلايا الخاضعة للرقابة ولدراسة استجابة الخلية في المختبر. يمكن تطبيقه على أنظمة أخرى بما في ذلك توصيل الأدوية وهندسة الأنسجة. قم بإعداد المواد لتكوين الهيدروجيل كما هو موضح في بروتوكول النص.

قم بتوصيل عدسة موازاة بنهاية موجه الضوء المملوء بالسائل لضمان شدة إضاءة متساوية نسبيا عبر جميع العينات. اضبط مسافة دليل الضوء من العينات لتحقيق حجم بقعة يغطي العينات ذات الأهمية. لصنع هيدروجيل غير منقوش ، قم بإعداد هيدروجيليات سميكة مصبوبة في أطراف الحقنة عن طريق سحب 10 إلى 20 ميكرولترا من محلول سلائف الجل في طرف حقنة مقطوعة معقمة.

اصنع هلام واحد لكل حقنة يبلغ سمكها حوالي 0.5 إلى 1.5 ملليمتر ، بناء على الحجم وقطر المحقنة. قم بإعداد الهلاميات المائية الرقيقة في قوالب الشرائح الزجاجية عن طريق وضع الحشية المطاطية حول حواف الشريحة الزجاجية غير المطلية. بعد ذلك ، ضع الماصة من خمسة إلى 10 ميكرولترات من محلول سلائف الجل على الشريحة الزجاجية غير المطلية.

وضع الشريحة الزجاجية المطلية بمضاد للالتصاق أعلى محلول الجل. قم بتأمين الشرائح الزجاجية بمشابك رابطة صغيرة لتحقيق الاستقرار. اضبط شدة المصباح لتحقيق 10 مللي واط لكل سنتيمتر مربع على سطح الجل لقوالب طرف الحقنة أو قوالب الشرائح الزجاجية.

استخدام مقياس إشعاعي للكشف عن الشدة. ووضع القوالب تحت المصباح. ضع الضوء لمدة دقيقة إلى خمس دقائق للسماح بالبلمرة الكاملة للمواد الهلامية.

استخدم وقت بلمرة أقصر للمواد الهلامية التي تحتوي على نسبة عالية من البولي إيثيلين جلايكول تيريفثاليت. ووقت أطول للمواد الهلامية ذات المحتوى المنخفض لإنتاج المواد الهلامية المائية المبلمرة بالكامل مع وحدات ضمن نطاق الأنسجة الرخوة. ضع المواد الهلامية من قوالب طرف المحقنة في صفيحة معقمة غير معالجة 48 بئر ، وضع الشرائح الزجاجية في طبق معقم.

لتحضير الهلاميات المائية المزخرفة ، قم بإعداد محلول السلائف كما هو موضح في بروتوكول النص وماصة المحلول بقوة لضمان خلط المحلول بشكل متساو. بعد ذلك ، قم بتغطية المواد الهلامية مسبقة التشكيل بببتيد خماسي في محلول البادئ الضوئي لفوسفات الليثيوم ، واحتضانها لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، قم بإزالة المحلول الزائد.

إذا تم تشكيل المواد الهلامية في طرف حقنة ، فاستخدم ملعقة لنقلها بعناية من لوحة 48 بئر إلى شريحة زجاجية معقمة للزخرفة. ضع قناع صور بالنمط المطلوب مباشرة فوق المحقنة والمواد الهلامية المصبوبة بالشريحة الزجاجية. تأكد من أن الجزء المطبوع من القناع يلامس الجل للحصول على دقة مثالية للنمط.

ضع العينات تحت المصباح وتشع لمدة دقيقة واحدة. بعد الزخرفة ، ضع المواد الهلامية المصبوبة بالحقنة في صفيحة معقمة 48 معالجة بثقافة الأنسجة بشكل جيد. ضع المواد الهلامية المصبوبة بشريحة زجاجية ملتصقة بالشرائح الزجاجية في طبق معقم.

اشطف ثلاث مرات ، 15 دقيقة بوسط مزروع أو المخزن المؤقت المناسب بناء على التجارب المخطط لها. للتحضير للكشف عن الثيول الحرة وقياسها في الهلاميات المائية المنقوشة ضوئيا ، قم أولا بإعداد المحاليل وإجراء العمليات الحسابية كما هو موضح في بروتوكول النص. شكل هيدروجيل رقيق للزخرفة كما كان من قبل.

على وجه التحديد ، اصنع المواد الهلامية التي تحتوي على الثيول الحرة الزائدة وقم بنمط نصف هذه العينات باستخدام الببتيد البنتون باستخدام زلة غطاء شفافة لتعريض الجل بالكامل بالضوء. ضع المواد الهلامية المزخرفة وغير المنقوشة في آبار من 48 بئر. اشطفها لمدة 15 دقيقة ، ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت لتفاعل إلمان ، للسماح بانتشار الأنواع النهائية المتفاعلة خارج الجل وتورم التوازن.

أضف حاجزا إضافيا لتفاعل Ellman إلى المواد الهلامية للشطف ، بحيث يكون حجم الجل المتورم مع المخزن المؤقت للتفاعل مضاعفا ل 20 ميكرولترا. على سبيل المثال ، إذا كان حجم الجل المتورم المتوقع هو 15 ميكرولتر ، فأضف خمسة ميكرولترات من المخزن المؤقت للتفاعل. وإذا كان حجم الجل المتورم المتوقع 30 ميكرولتر ، فأضف 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتفاعل.

ماصة المعايير [سستين] داخل آبار فردية من 48 بئر صفيحة في مضاعفات من 20 ميكرولتر. اعتمادا على الحجم المستخدم في الخطوة السابقة. على سبيل المثال ، إذا كانت الخطوة السابقة تحتوي على حجم هلام منتفخ ، بالإضافة إلى مخزن مؤقت إضافي للتفاعل يساوي 40 ميكرولترا ، أضف 40 ميكرولترا من كل معيار إلى الآبار الفارغة الفردية.

بعد ذلك ، قم بتخفيف كاشف إلمان ومخزن التفاعل. أضف كاشف إلمان المخفف إلى الآبار التي تحتوي على معايير وعينات. للحصول على عينة 20 ميكرولتر ، أضف 183.6 ميكرولتر من المحلول لكل بئر.

احتضن أو ضعه على شاكر لمدة ساعة وثلاثين دقيقة ، أو حتى يتطابق لون المحلول مع لون المواد الهلامية عن طريق الفحص البصري ، لضمان الانتشار الكافي للديانيون الأصفر 2-Nitro-5-thiobenzoic ، والذي يتم إنشاؤه عند تفاعل كاشف إلمان مع الثيول الحرة من الجل. خذ 100 ميكرولتر من المحلول من العينات والمعايير وضعها في آبار من لوح 96 بئر. اقرأ الامتصاص عند 405 نانومتر على قارئ الألواح.

لتصور أنماط الصور ، قم بإزالة المخزن المؤقت للتفاعل الزائد عن طريق المسح برفق حول حواف الهيدروجيل بمنديل. كاشف ماصة إلمان مباشرة على سطح الجل. قم بالتصوير على الفور على مجهر ضوئي بمعدل 10x أو على مجهر استريو بكاميرا ملونة.

اجمع الخلايا وقم بإعدادها للتغليف كما هو موضح في بروتوكول النص. مباشرة بعد شفط PBS ، قم بتعليق الخلايا المحببة في محلول السلائف إلى تركيز نهائي يبلغ خمسة آلاف خلية لكل ميكرولتر. اترك تركيزا مناسبا من الثيول الحرة للتفاعل لاحقا مع الببتيد البنتوني.

إذا كان نمط الصورة مطلوبا. قم بالعفن والبلمرة والتشكيل الهلامي المائي كما كان من قبل. اشطف المواد الهلامية لمدة 10 دقائق ، ثلاث مرات ، في وسط النمو بعد الزخرفة لإزالة الأنواع غير المتفاعلة والبادئ الضوئي الزائد لفوسفات الليثيوم.

احتضان المواد الهلامية في وسط النمو عند 37 درجة Celius وخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون حتى النقطة الزمنية المطلوبة لمزيد من التحليل. قم بتجديد الوسيط كل 48 ساعة ، أو على النحو الذي تحدده التطبيقات. لتحديد صلاحية الخلية المغلفة ، قم أولا بإزالة وسط النمو من المواد الهلامية واشطفها لمدة 15 دقيقة ، ثلاث مرات ، باستخدام PBS للسماح بانتشار الوسط من المواد الهلامية.

أضف ميكرولترين من اثنين من مليمولار من homodimer-1 المذابة ، و 0.5 ميكرولتر من محاليل الكالسيوم AN المذابة بأربعة ملليمولار ، إلى مليلتر واحد من PBS المعقم. دوامة لضمان الخلط الكامل. أضف 300 ميكرولتر من المحلول القائم إلى كل هلام قالب حقنة في 48 لوحا جيدا ، أو ما يكفي لتغطية سطح الجل على شريحة زجاجية في طبق معقم.

واحتضن لمدة 45 دقيقة. قم بإزالة المحلول القائم الزائد واشطفه لإزالة الصبغة الزائدة من المواد الهلامية. صور الخلايا على مجهر متحد البؤر.

أو على مجهر epifluorescence مع القدرة على 10x. وإثارة 488 نانومتر وانبعاث 525 نانومتر. أظهر تركيز الثيول الحر للهلاميات المائية غير المزخرفة والمنقوشة التي تم تحديدها كميا باستخدام Ellman's أن الهلاميات المائية البوليمرية في البداية لمدة دقيقة واحدة ولمدة خمس دقائق لها تركيزات ثيول حرة متشابهة إحصائيا ، مما يشير إلى رد فعل سريع وتبلور كامل في غضون دقيقة واحدة.

الزخرفة السائبة اللاحقة للمواد الهلامية المحتضنة بببتيدات البنتون لمدة 30 دقيقة ، ولمدة ساعة و 30 دقيقة ، لديها انخفاض بنسبة 60 إلى 80 في المائة في تركيز الثيول الحر ، مما يشير إلى التعديل الفعال للثيول الزائد. يمكن ملاحظة أنماط الصور التي تشكلت من الضوء الساطع من خلال العينات المغطاة بالأقنعة ، المطبوعة هنا بخطوط ، في بعدين مع تطبيق كاشف إلمان. أو ، في ثلاثة أبعاد مع دمج الببتيدات الفلورية في التصوير اللاحق.

تمت معالجة الخلايا الجذعية البشرية البالغة المغلفة داخل hyrogels ببقع البقاء والسمية المائية. وتم تصويرها باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. يتم تصنيف الخلايا القابلة للحياة التي لا تحتوي على تلف في الغشاء باللون الأخضر وتشير إلى بقاء الخلايا بعد يوم واحد من التغليف.

تبدأ الخلايا في الانتشار داخل المصفوفة بعد ستة أيام من التغليف. كما هو موضح في الصورة الداخلية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على إجراءات معالجة معقمة ودقيقة لمنع تلف الخلايا بعد التغليف من خلال إدخال الملوثات أو الشفافية الميكانيكية.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل قياس التدفق الخلوي للتلطيخ المناعي والتعبيرات الجينية لدراسة وظيفة الخلية ومصيرها استجابة للبيئة الخلوية الخارجة. تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجالات علم الأحياء والهندسة الحيوية والطب ، لدراسة تآكل منطقة الأنسجة أو تطور المرض في المصفوفات الاصطناعية خارج الخلية مع التحكم في الخصائص المحددة من قبل المستخدم ، نحو تطوير استراتيجيات علاج جديدة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تغليف الخلايا ، ونمط المصفوفات الناعمة لدراسات زراعة الخلايا الخاضعة للرقابة.