جزيء واحدة سوبر قرار تصوير فوسفتيدلينوستول 4،5-bisphosphate في غشاء البلازما مع رواية المسابر نيون

الهدف العام من هذا العمل هو إصدار التوزيع النانوي للفوسفاتيديلينوسيتول 4 ، 5-ثنائي الفوسفات في غشاء بلازما الخلية باستخدام الفحص المجهري لتوطين مضان الجزيء الواحد. تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول إشارات الفوسفينوزيتايد. مثل ما هو التنظيم النانوي للفوسفوينوسيتيدات تحت مركب الإشارات في غشاء الخلية؟

تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في الدقة المكانية العالية وتجاوز معالجة المنظفات التي تعد مصدر قلق كبير في الدراسات المورفولوجية للفوسفوليبيد. يتضمن هذا النهج ثلاث خطوات رئيسية. الخطوة الأولى: تحضير ورقة غشاء البلازما من الخلايا الحية.

الخطوة الثانية: وضع العلامات على الفوسفوينوزيتيد وتصوير الإزهار بجزيء واحد. الخطوة الثالثة: توطين الجزيء الفردي وإعادة بناء التصوير. في يوم التجربة ، ينزلق غطاء المعطف بنصف إلى مليلتر واحد من PDL.

بعد ساعة أو ساعتين ، امتصاص PDL الزائد بالمناديل الورقية من حافة زلة الغطاء. ثم قم بتخزين زلات الغطاء على صفيحة معدنية عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، اغسل خلايا INS-1 التي تم نقلها مسبقا والتي نمت على زلات الغطاء بنصف إلى مليلتر واحد من PBS المثلج الذي يحتوي على مليمول EGTA.

كرر هذا الغسيل ثلاث مرات وامتص PBS الزائد. الآن باستخدام الملقط ، ضع زلات الغطاء مع الخلايا المزروعة على زلات الغطاء المطلي ب PDL ، بحيث يكون جانب الخلية لأسفل. افعل ذلك على اللوح المعدني المبرد.

ثم انقل اللوحة إلى أربع درجات مئوية لمدة سبع إلى عشر دقائق لمنح الخلايا وقتا للارتباط. بعد ذلك ، استخدم الملقط لإزالة الغطاء المحمل بالخلية برفق والذي سيترك وراءه طبقة رقيقة من غشاء الخلية على الغطاء المطلي ب PDL. ثم اغسل صفائح الغشاء برفق بنصف إلى مليلتر واحد من PBS المثلج.

الآن قم بإصلاح كل ورقة غشائية في حوالي 150 ميكرولتر من الثلج البارد وأربعة بالمائة من PFA مع 0.2 في المائة من الجلوتارالديهايد في PBS. اترك الأغشية تثبت لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بعد التثبيت ، قم بمتابعة التصوير على الفور أو قم بتغطية المستحضرات ب PBS المثلج وتخزينها عند أربع درجات مئوية.

إذا كانت مجسات الأس الهيدروجيني قيد الاستخدام ، يوصى بشدة بالتصوير الفوري. لهذا الإجراء ، يتم استخدام نظام SMLM القائم على مجهر TIRF. قبل تصوير الأغشية ، قم بتخفيف ميكرولتر واحد من محلول حبة الفلورسنت في 10 ملليلتر من PBS مع 50 ملليمولار من كلوريد المغنيسيوم.

ثم قم بتحميل عينة في غرفة التصوير وأضف 200 ميكرولتر من المحلول المخفف ثم انتظر 10 دقائق. بعد ذلك ، اغسل العينة باستخدام PBS ثلاث مرات. ابدأ الآن نظام التصوير PALM.

في برنامج التصوير المقترن، حدد زر قناة iRFP. ثم ابحث عن غشاء الخلية الذي يعبر عن مجسات الأس الهيدروجيني في قناة iRFP ، واستخدم حبات الفلورسنت لتصحيح الانجراف. قم بتعيين زاوية TIRF العادية على أنها 2140 وهي أعمق بمقدار 1.5 من الزاوية الحرجة TIRF ويجب أن تكون الزاوية الافتراضية.

ثم استخدم زر الالتقاط لتجميع صورة TIRF تقليدية في قناة iRFP كمرجع. بعد ذلك ، قم بالتبديل إلى قناة PAm-Cherry1 بالنقر فوق الزر قناة RFP. ثم اضبط شريط التمرير في لوحة AOTF على طول الطريق إلى اليمين للحصول على إضاءة كاملة وقم بتطبيق الليزر لمدة 10 إلى 20 ثانية لتبييض إزهار غشاء الخلفية.

بعد ذلك ، اضبط إعداد الكاميرا الأمثل ضمن علامة تبويب التنسيق إلى اثنين في اثنين من binning. ثم اضبط بروتوكول الاستحواذ السريع ضمن علامة التبويب اكتساب تسلسل ND إلى 30 000 صورة بمعدل 20 هرتز. ثم قم بتطبيق طاقة 0.1 إلى واحد بالمائة على الليزر 405 نانومتر أثناء الحصول على الصورة بحيث يمكن التعرف بسهولة على النقاط المعزولة مكانيا في كل إطار.

احصل الآن على صور PAm-Cherry1 بالنقر فوق الزر "تشغيل الآن". سينخفض عدد الجزيئات التي يمكن تنشيطها تدريجيا أثناء عمليات الاستحواذ. ردا على ذلك ، قم بزيادة شدة الليزر 405 نانومتر تدريجيا للحفاظ على الكثافة المثلى للإشارات.

احصل على الصور حتى يتم تنشيط كل إشارة PAm-Cherry1. في وقت لاحق عند الخضوع لمعالجة الصور وإعادة بنائها ، حدد الأحداث الجزيئية الفردية من كل إطار وتوطينها. قم بتعيين عتبة شدة التصفية برقم العتبة في المويجة.

توفير مزيد من التفاصيل في بروتوكول النص. التوزيع المكاني PIP2 حساس للتثبيت المختلف مع التثبيت المناسب الموصوف في النص ، أظهرت مجسات PIP2 توزيعا ثابتا عند تصنيفها بواسطة الجسم المضاد PIP2 أو مجالات الأس الهيدروجيني المحددة. بالمقارنة ، لا تظهر الخلايا الحية المصنفة بمجالات الأس الهيدروجيني الموسومة ب EGFP بشكل مختلف كثيرا.

أظهرت جميع العينات توزيعا متساويا للمجسات. في المقابل ، أدى التثبيت غير الأمثل إلى مجموعات PIP2 شديدة الكثافة وانخفاض في شدة الإشارة. في ظل ظروف التثبيت المثلى ، كشفت صور الدقة الفائقة ل PIP2 في الخلايا الثابتة عن توزيع متجانس للمجسات في جزء كبير من غشاء البلازما بتدرجات تركيز محدودة فقط.

بعض البقع الغشائية المخصبة بمجسات PIP2 حيث تم توزيعها بشكل ضئيل ولها أحجام مختلفة. عرضت صور PALM للخلايا الحية توزيعا مكانيا مشابها للخلايا الثابتة. كشف التحليل التفصيلي لإشارات PIP2 أن ديناميكياتها كانت سريعة في المناطق المحلية ولكن هذا لم يؤد إلى تغييرات كبيرة في وفرة الإجمالية.

تقدم هذه التقنية طريقة جديدة للباحثين في مجال الدهون الفوسفورية لاستكشاف توزيع ونشاط الأنواع الفرعية الأخرى من الفوسفوينوسيتيد في ظل الظروف الفسيولوجية.