"يبلوع إغلاق الفحص" لتصور يبلوع تشكيل في ثلاثة أبعاد عن طريق التأمل إجمالي الداخلية نيون الميكروسكوب (TIRFM)

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تصوير تكوين الجسيم البلعمي، بالإضافة إلى الموقع الدقيق لانقسام الجسيم البلعمي ثلاثي الأبعاد في الخلايا البلعمية الحية، وذلك باستخدام مجهر الفلورة بالانعكاس الداخلي الكلي، أو مجهر TIRF. تجمع هذه الطريقة بين مجهر TIRF والفلورة فوق المجهرية لمراقبة التموضع التدريجي لبروتينين فلوريين مختلفين أثناء تمدد الأقدام الكاذبة والاندماج الطرفي. وتوفر هذه التقنية منهجية منظمة لتحديد الزاوية الحرجة والحصول على إشارة TIRF، وهو أمر بالغ الأهمية لاستخلاص الاستنتاجات حول المنطقة القريبة من الغشاء البلازمي.

في اليوم الذي يسبق جلسة المجهر TIRF، قم بتشغيل غرفة التسخين على درجة حرارة 37 °C للسماح بتسخين متجانس لمنصة المجهر. وفي صباح اليوم التالي، استخدم 100 µL من PBS، المضاف إليه 0.1%BSA لغسل 7x10⁶ من كرات الدم الحمراء للأغنام أو SRBCs لكل طبق زجاجي القاعدة بقطر 35 mm مرتين. وبعد عملية الطرد المركزي الثانية، أعد تعليق الخلايا في 500 µL من rabbit IGG anti-SRBCs، بتركيز دون التلازن، في PBS مضاف إليه 0.1%BSA لكل 5 µL من الخلايا، ثم قم بحضن الخلايا لمدة 30 دقيقة مع تدوير بطيء.

في نهاية فترة الحضن، اغسل خلايا كرات الدم الحمراء للأرانب (SRBCs) مرتين في محلول PBS مضاف إليه BSA، ثم أعد تعليق الخلايا في 2 ملليلتر من وسط مجهري خالي من المصل بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لكل طبق. بعد ذلك، عالج أطباقاً ذات قاعدة زجاجية مقاس 35 مليمتر باستخدام 2 ملليلتر من poly-L lysine بتركيز 0.1% لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، متبوعاً بغسلتين باستخدام 2 ملليلتر من PBS. وللتثبيت غير التساهمي لخلايا SRBCs، اسكب 2 ملليلتر من الخلايا المكسوة بـ IGG في كل طبق من الأطباق المطلية بالـ polylysine، ثم قم بطرد العينات مركزياً في جهاز طرد مركزي ذو دوار متأرجح.

تخلص من السوائل الطافية واغسل الجسيمات مرة واحدة باستخدام 2 milliliters من PBS مضافاً إليه 10%BSA. بعد ذلك، قم بتحضين الجسيمات مع 2 milliters من PBS طازج مضافاً إليه 10%BSA لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، يليه ثلاث غسلات باستخدام 2 milliliters من PBS. وبعد الغسلة الأخيرة، استبدل PBS بـ 2 milliliters من وسط مجهري خالٍ من المصل عند درجة حرارة 37-degree Celsius.

ضع طبقاً مغلفاً بـ SRBC على منصة المجهر. بعد ذلك، قم بكشط الخلايا المُحوّلة المطلوبة من قاع طبق المزرعة، واسحب الخلايا بالماصة عدة مرات للحصول على معلق من الخلايا المفردة. أضف الخلايا المُحوّلة إلى الطبق المغلف بـ SRBC.

قم بتشغيل برنامج التصوير الحي. ابحث عن خلية تعبّر عن البروتينات الموُسمة بفلورسنت، واضبط موضع الطبق بحيث تكون الخلية المستهدفة في منتصف مجال الرؤية. قم بالتقاط 500 صورة بزوايا مختلفة من صفر إلى 5% بزيادات قدرها 0.01 درجة، عند طول موجي واحد للإثارة.

لتحديد الزاوية الحرجة للضوء الساقط ليكون منعكساً كلياً عند الواجهة بين الزجاج والوسط، وتوليد موجة متلاشية، افتح تسلسل الصور في برنامج التصوير المناسب. حدد منطقة اهتمام في الخلية ذات فلورية منتظمة. ثم، ضمن علامة تبويب الصور (Image)، اختر المجموعات (Stacks)، ورسم ملف المحور Z (Plot Z Axis Profile).

لرسم مخطط لمتوسط شدة الفلورة لملف المحور z المقاسة في المنطقة ذات الاهتمام كدالة للزوايا على المحور x. يمكن بعد ذلك استخدام أي قيمة زاوية على المحور x، تكون أكبر من الزاوية الحرجة، خلال جلسة المجهر للحصول على إشارة TIRF. بعد ذلك، في برنامج الاستحواذ المباشر، استخدم محرر البروتوكول لضبط بارامترات الاستحواذ.

بما في ذلك عدد تسلسلات اكتساب الحلقات، والقنوات الفلورية وكثافة الليزر الخاصة بها، وزاوية TIRF، ووقت التعرض. اضبط تحريك Z للعدسة الشيئية للوصول إلى مستوى وضع الفلورة فوق السطحية. ثم، في وضع الفلورة فوق السطحية، اضبط زاوية TIRF على 1، وأعد تحريك Z للعدسة الشيئية إلى مستوى TIRF.

بعد ذلك، احصل على صورة للخلية في وضع إضاءة LED الساطعة. الآن، ابحث عن خلية ذات أهمية تظهر مستوى متوسطاً من تعبير البروتين الموسوم فلورياً، وتشارك في عملية البلعمة مع SRBC، ثم حرك الخلية إلى منتصف الحقل. لاحظ أنه يمكن التعرف على هذه الخلية من خلال غشاء بلازمي ممتد حول الجسيم.

أدخل عدد الإطارات في علامة تبويب "Loop Count" لبدء عملية استحواذ تدفقي تتراوح من 500 إلى 1,000 إطار. إذا لزم الأمر، قم بتغيير شدة الليزر ووقت التعرض للتكيف مع المستويات المختلفة من الفلورة في الخلية. ولإنشاء تسلسلين منفصلين من الصور يتوافقان مع القناتين، افتح التسلسلات في برنامج التصوير وانقر فوق علامة تبويب "Image".

من قائمة Hyperstacks، اختر Stack to Hyperstack. بعد ذلك، وفي النافذة المنبثقة، أدخل xyctz في خانة Order، وعدد الفلوروكروما المستخدمة في خانة Channels، وعدد المقاطع (Slices) في المحور z، وعدد الصور مقسوماً على عدد القنوات في خانة Frames، وGrayscale في وضع العرض Display Mode. ثم، قم بفصل القنوات.

يظهر هنا مقطع فيديو تمثيلي لمجهر TIRF للخلايا الحية لاختبار إغلاق الجسيم البلعمي في خلايا البلاعم raw 264.7 أثناء التهام خلية دم حمراء من غنم (SRBC) مُطَلّاة بـ IGG. ومع تلاقي أطراف الأقدام الكاذبة المقابلة للغطاء الزجاجي حول الـ SRBC، يتم رصد حلقة من F-actin في منطقة TIRF تضيق تدريجياً حتى تنغلق. وبالتوازي مع ذلك، فإن إشارة F-actin الضبابية التي يتم رصدها بواسطة الفلورة فوق النابذة (epifluorescence)، بعد إزاحة المنصة بمقدار ثلاثة ميكرونات فوق منطقة TIRF، تتوافق مع عملية إزالة البلمرة عند قاعدة الكأس البلعمي.

بعد ثلاث دقائق، يتم استيعاب خلية الدم الحمراء لجرذان (SRBC) بالكامل داخل الخلية، وهو ما تم تأكيده بواسطة التصوير بالضوء النافذ. وباستخدام هذه الطريقة، يمكن توضيح توزيع الأكتين عند قاعدة الكأس البلعمي، حيث تحدث عملية الإفراز الخلوي البؤري للمقصورات داخل الخلوية. وبعد عملية الاستحواذ، يمكن معالجة الخلية بشكل إضافي لإجراء المجهر الإلكتروني الارتباطي، أو يمكن تثبيت وتجميد مجتمع الخلايا بالكامل لمعالجته باستخدام مجهر الفلورة المناعية التقليدي.

من المهم أن نضع في الاعتبار أن عملية البلعمة حساسة جداً لدرجة الحرارة، ولذلك، يجب الحفاظ على درجة حرارة ثابتة تبلغ 37 درجة مئوية داخل غرفة التسخين وفي وسط طبق المزرعة طوال فترة الإجراء. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عملية الطلاء (opsonization) للجزيئات، وطلاء الشرائح الغطائية بهذه الجزيئات، وتحديد الزوايا الحرجة لمجهر الفلورة العكسية الانعكاسية (TIRF)، وتصوير تموضع البروتينات المستهدفة أثناء عملية البلعمة في الخلايا الحية.