"يبلوع إغلاق الفحص" لتصور يبلوع تشكيل في ثلاثة أبعاد عن طريق التأمل إجمالي الداخلية نيون الميكروسكوب (TIRFM)

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تصور تكوين البلعمة ، بالإضافة إلى الموقع الدقيق لانقسام البلعمة في 3D ، في البلاعم الحية ، باستخدام الإزهار الانعكاس الداخلي الكلي ، أو المجهر TIRF. تجمع هذه الطريقة بين الفحص المجهري TIRF والتألق السطحي لمراقبة التوطين خطوة بخطوة لبروتينين فلوريين مختلفين أثناء تمديد الأرجل الكاذبة واندماج الطرف. توفر هذه التقنية طريقة منهجية لتحديد الزاوية الحرجة والحصول على إشارة TIRF وهو أمر بالغ الأهمية لاستخلاص استنتاجات حول القرب من غشاء البلازما.

في اليوم السابق لجلسة مجهر TIRF ، قم بتشغيل غرفة التسخين إلى 37 درجة مئوية للسماح بتسخين متجانس لمرحلة المجهر. في صباح اليوم التالي ، باستخدام 100 ميكرولتر من PBS ، مكملة ب 0.1٪ BSA لغسل 7 × 10 إلى خلايا الدم الحمراء السادسة للأغنام أو SRBCs لكل طبق زجاجي 35 ملم مرتين. بعد الطرد المركزي الثاني ، قم بتعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من الأرانب IGG المضادة لكرات الدم SRBC ، بتركيز فرعي تراص ، في PBS مكمل بنسبة 0.1٪ BSA لكل 5 ميكرولتر من الخلايا ، واحتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة مع دوران بطيء.

في نهاية الحضانة ، اغسل كرات الدم السرطانية مرتين في PBS بالإضافة إلى BSA ، وأعد تعليق الخلايا في 2 مل من 37 درجة مئوية ، وسط الفحص المجهري الخالي من المصل لكل طبق. بعد ذلك ، قم بمعالجة الأطباق ذات القاع الزجاجي مقاس 35 ملم ب 2 ملليلتر من 0.1٪ بولي ليسين لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، متبوعة بغسلتين مع 2 مل من PBS. للتثبيت غير التساهمي ل SRBCs ، صب 2 ملليلتر من الخلايا المضادة ل IGG في كل من الأطباق المطلية بالبولي ليسين وقم بالطرد المركزي للعينات في جهاز طرد مركزي دوار متأرجح.

تخلص من المواد الطافية واغسل الجزيئات مرة واحدة باستخدام 2 مل من PBS بالإضافة إلى 10٪ BSA. بعد ذلك ، احتضان الجزيئات ب 2 مل من PBS الطازج بالإضافة إلى 10٪ BSA لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، متبوعة بثلاث غسلات مع 2 مل من PBS. بعد الغسيل الأخير ، استبدل PBS ب 2 مل من 37 درجة مئوية ، وسط الفحص المجهري الخالي من المصل.

ضع طبقا مغطى ب SRBC على مرحلة المجهر. بعد ذلك ، اكشط الخلايا المنقولة ذات الأهمية من قاع طبق الثقافة ، وقم بماصة الخلايا عدة مرات لتحقيق تعليق أحادي الخلية. أضف الخلايا المنقولة إلى الطبق المغطى ب SRBC.

ابدأ برنامج الاستحواذ المباشر. ابحث عن خلية تعبر عن البروتينات ذات العلامات الفلورية ، واضبط موضع الطبق بحيث تكون الخلية ذات الأهمية في منتصف المجال. احصل على 500 صورة بزوايا مختلفة من صفر إلى 5٪ بزيادات قدرها 0.01 درجة ، بطول موجي واحد للإثارة.

لتحديد الزاوية الحرجة للضوء الساقط لينعكس بالكامل على الواجهة الزجاجية المتوسطة ، وتوليد موجة زائلة ، افتح تسلسل الصورة في برنامج التصوير المناسب. حدد منطقة الاهتمام في الخلية ذات التألق المنتظم. ثم ، ضمن علامة التبويب صورة ، حدد المكدسات ، ورسم ملف تعريف المحور Z.

لرسم ملف تعريف المحور z يعني شدة التألق المقاسة في منطقة الاهتمام مع وظيفة الزوايا على المحور x. يمكن بعد ذلك استخدام أي قيمة زاوية على المحور x ، أعلى من الزاوية الحرجة ، أثناء جلسة الفحص المجهري للحصول على إشارة TIRF. بعد ذلك ، في برنامج الاستحواذ المباشر ، استخدم محرر البروتوكول لتعيين معلمات الاستحواذ.

بما في ذلك عدد تسلسلات اكتساب الحلقة ، وقنوات الفلورسنت وشدة الليزر الخاصة بها ، وزاوية TIRF ، ووقت التعرض. اضبط حركة Z للهدف للوصول إلى مستوى وضع التألق. بعد ذلك ، في وضع التألق ، اضبط زاوية TIRF على 1 ، وتحرك Z للهدف مرة أخرى إلى مستوى TIRF.

بعد ذلك ، احصل على صورة للخلية في وضع LED للضوء الساطع. الآن ، ابحث عن خلية ذات أهمية ذات مستوى معتدل من تعبير البروتين الموسوم بالفلورسنت ، وتشارك في البلعمة باستخدام SRBC ، وانقل الخلية إلى منتصف المجال. لاحظ أنه يمكن التعرف على هذه الخلية بواسطة غشاء بلازما ممتد حول الجسيم.

أدخل عدد الإطارات في علامة التبويب Loop Count لبدء الحصول على دفق من 500 إلى 1,000 إطار. إذا لزم الأمر ، قم بتغيير شدة الليزر ووقت التعرض للتكيف مع المستويات المختلفة من التألق في الخلية. لإنشاء تسلسلين منفصلين للصور يتوافقان مع القناتين ، افتح التسلسلات في برنامج التخيل وانقر فوق علامة التبويب صورة.

في قائمة Hyperstacks، حدد Stack to Hyperstack. بعد ذلك ، في النافذة المنبثقة ، أدخل xyctz للترتيب ، وعدد الفلوروكروم المستخدم للقنوات ، وعدد الشرائح في المحور z ، وعدد الصور مقسوما على عدد القنوات ضمن الإطارات ، وتدرج الرمادي لوضع العرض. ثم قم بتقسيم القنوات.

هنا ، يتم عرض فيلم مجهري TIRF تمثيلي للخلية الحية لمقايسة إغلاق البلعمة في 264.7 ضامة خام تبتلع SRBC المعيار IGG. نظرا لأن أطراف الأرجل الكاذبة المعارضة للغطاء الزجاجي تنزلق حول SRBC ، يتم اكتشاف حلقة F-actin في منطقة TIRF التي تضيق تدريجيا حتى تغلق. في موازاة ذلك ، فإن إشارة F-actin الضبابية التي تم اكتشافها بواسطة epifluroescence ، بعد تحويل المرحلة ثلاثة ميكرونات فوق منطقة TIRF تتوافق مع إزالة البلمرة في قاعدة الكوب البلعمي.

بعد ثلاث دقائق ، يتم استيعاب SRBC تماما ، كما يؤكد التصوير الضوئي المرسل. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن إثبات الأكتين في قاعدة الكأس البلعمية هو إفراز الخلايا البؤري للمقصورات داخل الخلايا. بعد الحصول عليها ، يمكن معالجة الخلية بشكل أكبر للفحص المجهري الإلكتروني المترابط ، أو يمكن إصلاح مجموعة الخلايا بأكملها وتجميدها لمعالجة الفحص المجهري المناعي الكلاسيكي.

من المهم أن تضع في اعتبارك أن البلعمة حساسة جدا لدرجة الحرارة ، وبالتالي ، يجب الحفاظ على درجة الحرارة داخل غرفة التسخين ووسط طبق الثقافة عند درجة حرارة ثابتة تبلغ 37 درجة مئوية طوال العملية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية معالجة الجسيمات ، وانزلاق غطاء الغطاء مع الجسيمات ، وتحديد الزوايا الحرجة للفحص المجهري TIRF ، وتصوير توطين البروتينات ذات الأهمية أثناء البلعمة الخلوية الحية.