تقييم سريع ومحدد من Halogenating البيروكسيد آخر في عينات الدم التخصيب خلايا الدم البيضاء
يوليو 28, 2016
يصف هذا البروتوكول التخصيب السريع للكريات البيض من عينات الدم الصغيرة لتحديد محدد لاحق لنشاط البيروكسيديز المهلوجني داخل الخلايا. يمكن تطبيق الطريقة على المواد البشرية وغير البشرية وقد تساهم في تقييم علامات الالتهابات الجديدة.
الهدف العام من طريقة استنفاد كريات الدم الحمراء هذا هو تحقيق تخصيب سريع وبسيط للكريات البيض من عينة دم صغيرة. تتمثل العديد من مزايا هذه التقنية في أنها رخيصة وموثوقة وسريعة. علاوة على ذلك ، يمكن تطبيقه على عينات الدم البشرية وغير البشرية.
قبل البدء في إجراء التحلل، اضبط الماصة لإعطاء المياه على ملليلتر، والماصة ل PBS إلى خمسة ملليلتر. ثم ضع قوارير مفتوحة من الماء و PBS تحت غطاء تدفق رقائقي في درجة حرارة الغرفة. نظرا لأن التحلل المنخفض التوتر هو عملية حرجة من حيث الوقت ، فيجب تحضير كل شيء مسبقا.
علاوة على ذلك ، يجب أن يتم إجراء عملية التحلل دائما بنفس الطريقة ، للحصول على نتائج متوافقة. بعد ذلك ، انقل 100 ميكرولتر من كل عينة دم إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. وأضف ملليلترين من الماء المقطر إلى كل عينة مع دوامة في الإعداد المتوسط.
ضع الخلايا لمدة 60 ثانية ، ثم أضف خمسة ملليلتر من PBS. وخلط العينات عن طريق الدوامة. الآن ، اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، وصب المواد الطافية.
اقلب الأنابيب واضغط على الفتحات على منشفة ورقية لإزالة أكبر قدر ممكن من السوائل. ثم كرر إجراء التحلل الناقص كما هو موضح للتو. بعد الحصول على حبيبات جافة للمرة الثانية, أعد تعليق كل عينة في 500 ميكرولتر من HBSS, حتى يتم الحصول على محلول متجانس.
ونقل الخلايا إلى 1.5 ملليلتر ، أنابيب الطرد المركزي الدقيقة على الجليد. للتحقق من خصوصية البيروكسيديز للعينات بعد تلطيخ الفينول الأميني فلوريسين ، أو تلطيخ APF ، أضف أولا خمسة ميكرولترات من مثبط بيروكسيداز الهيم ، 4-ABAH ، إلى العينات المناسبة لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، أضف خمسة ميكرولترات من محلول عمل APF إلى كل أنبوب ، وقم بتدوير الخلايا برفق على الإعداد المتوسط.
احتضان جميع العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم أضف خمسة ميكرولترات من محلول عمل بيروكسيد الهيدروجين إلى كل عينة ، وقم بدوامة الأنابيب برفق. بعد 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، قم بالطرد المركزي للخلايا ، وقم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج الكريات.
أخيرا ، أعد تعليق الخلايا في 250 ميكرولتر من HBSS ، وقم بتخزين العينات في الظلام حتى تحليلها ، لتجنب تبييض الصورة. هنا ، يظهر مثال تمثيلي لمجموعات الكريات البيض بعد التحلل الناقص التوتر وتلوين APF كما هو موضح للتو. من خلال رسم حجم الخلية مقابل الحبيبات ، يمكن ملاحظة النضوب القوي لكريات الدم الحمراء ، حيث تمثل خلايا الدم الحمراء والحطام 22٪ فقط من الأحداث.
علاوة على ذلك ، فإن توزيع شدة التألق المشتق من APF يسهل التمييز الواضح بين كريات الدم الحمراء والخلايا الليمفاوية السالبة للبيروكسيداز ، مع ملاحظة أكسدة APF معتدلة ، للخلايا الوحيدة الموجبة للبيروكسيداز والحمضات ، وأكسدة البيروكسيديز القوية التي تظهرها العدلات. بمجرد إتقانها ، يمكن تطبيق هذه التقنية على ما يصل إلى 50 عينة دم بالتوازي إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تلطيخ الأجسام المضادة لتحديد المجموعات الفرعية للخلايا ذات الأهمية.
بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال دراسات الصغيرة لاستكشاف دور نشاط الهلوجين ل MPO و EPO في النماذج الحيوانية للأمراض الالتهابية المزمنة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يصف هذا البروتوكول طريقة سريعة وبسيطة لإثراء الكريات البيضاء من عينات دم صغيرة، وهي قابلة للتطبيق على المواد البشرية وغير البشرية على حد سواء. وتتميز هذه التقنية بكونها موفرة للتكلفة وموثوقة، مما يسهل عملية تقييم المؤشرات الالتهابية الجديدة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- علم المناعة
- بيولوجيا الخلية
خلفية علمية
- يعد إثراء الكريات البيضاء أمراً بالغ الأهمية لدراسة الاستجابات المناعية.
- يمكن أن تكون الطرق التقليدية مستهلكة للوقت ومعقدة.
- تهدف هذه الطريقة إلى تبسيط هذه العملية.
- يمكن استخدامها لعينات الدم البشرية وغير البشرية على حد سواء.
الغرض من الدراسة
- تطوير بروتوكول سريع لإثراء الكريات البيضاء.
- تقييم نشاط بيروكسيداز الهالوجين في الكريات البيضاء.
- المساهمة في تحديد العلامات الالتهابية.
الطرق المستخدمة
- تجهيز الماصّات لإعطاء الماء ومحلول PBS.
- استخدام غطاء التدفق الصفائحي لمعالجة العينات.
- التحلل ناقص التوتر لإزالة كريات الدم الحمراء.
- التنفيذ الدقيق لإجراء التحلل مع مراعاة عامل الوقت.
النتائج الرئيسية
- إثراء ناجح لخلايا الكريات البيضاء من عينات دم صغيرة.
- تقييم موثوق لنشاط بيروكسيديز.
- إمكانية التطبيق على العينات البشرية وغير البشرية على حد سواء.
- إمكانية تقييم علامات التهابية جديدة.
الاستنتاجات
- تتميز هذه الطريقة بالكفاءة والفعالية من حيث التكلفة.
- تعمل هذه الطريقة على تعزيز دراسة الاستجابات المناعية.
- يمكن للأبحاث المستقبلية أن تستند إلى هذا البروتوكول.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح هذا البروتوكول إثراءً سريعاً ومعياريًا للخلايا البيضاء من عينات دم صغيرة، مما يدعم جهود الاكتشاف المبكر في أبحاث الأمراض الالتهابية. ومن خلال قياس نشاط بيروكسيديز الهالوجين الخاص بـ MPO و EPO، يوفر هذا البروتوكول قراءة ميكانيكية للتحقق من الأهداف وتقليل المخاطر المرتبطة بالمسارات الحيوية. كما تسهل توافقية هذه الطريقة مع قياس التدفق الخلوي والصبغ بالأجسام المضادة دمجها في سير عمل الفحص والبحوث الانتقالية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير للصناعات الدوائية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء نشاط بيروكسيداز الخاص بكريات الدم البيضاء للتحقق من صحة MPO و EPO كأهداف علاجية في الالتهاب المزمن.
- القيمة التشغيلية: تستخدم حجماً أدنى من العينة (50–100 µL)، مما يسمح بأخذ عينات متكررة من نماذج الحيوانات الصغيرة لإجراء دراسات طولية حول ارتباط الهدف.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يجمع بين صبغ APF وقياس التدفق الخلوي لإنتاج قراءات كمية تعتمد على الفلورة لإنتاج HOCl/HOBr بغرض توحيد معايير المقايسة.
- القيمة التشغيلية: يتيح المعالجة عالية الإنتاجية لما يصل إلى 50 عينة بالتوازي، مما يدعم حملات الفرز القابلة للتوسع.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: تربط نشاط بيروكسيداز الكريات البيضاء بالعمليات الالتهابية ذات الصلة بالمرض، مما يدعم مواءمة المؤشرات الحيوية في النماذج قبل السريرية.
- القيمة التشغيلية: تعمل مع دماء البشر والقوارض على حد سواء، مما يتيح الاستمرارية الانتقالية بين الأنواع في التحقق من الأهداف.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن تسلسل عملية الاكتشاف، بدءاً من الاختبارات المبكرة لفرضيات الأهداف وصولاً إلى التحقق من الصلاحية في المرحلة ما قبل السريرية، ولا سيما في برامج المناعة والأمراض الالتهابية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات من خلال قياس نشاط بيروكسيداز النوعي للإنزيم في تجمعات كريات الدم البيضاء المنقاة.
- الفحص: توفر مخرجات كمية قابلة للتكرار عبر فلورة APF وقياس التدفق الخلوي، مما يتيح تقييم تأثير المركبات على نشاط البيروكسيداز.
- التحليلات: تولد بيانات قابلة للقياس لشدة الفلورة تسمح بمقارنة المجموعات الفرعية من الخلايا الموجبة للبيروكسيداز (العدلات، والخلايا الوحيدة، والخلايا الحمضية) تحت الظروف التجريبية.
- الأبحاث الانتقالية: تربط نشاط البيروكسيداز بآليات الأمراض الالتهابية، مما يدعم الاستمرارية قبل السريرية عند دمجها مع صبغ علامات سطح الخلية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يشكل إثراء كريات الدم البيضاء الموحد والكشف القائم على APF منصة قابلة لإعادة الاستخدام لبرامج أهداف التهابية متعددة.
الأثر التشغيلي وأثر المؤسسة
- القيمة العلمية: توفر ثقة تنبؤية في التحقق من الهدف عن طريق عزل نشاط البيروكسيداز في سلالات محددة من الكريات البيضاء.
- القيمة التشغيلية: توفر بروتوكولاً سريعاً ومنخفض التكلفة يتطلب الحد الأدنى من الأجهزة (جهاز طرد مركزي، وجهاز مزج دوامي، وجهاز قياس التدفق الخلوي).
- القيمة الاستراتيجية: تقلل الجداول الزمنية لتقليل المخاطر البيولوجية من خلال تمكين التقييم السريع والمتكرر لتعديل الهدف في عينات الكريات البيضاء.
- التأثير على المحفظة: تدعم تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر لمثبطات MPO/EPO من خلال تقديم بيانات مبكرة عن النشاط الوظيفي من خلايا ذات صلة فسيولوجياً.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في التعامل مع الكريات البيضاء، وقياس التدفق الخلوي، وكيمياء المسابير الفلورية.
- يعتمد على توفر أجهزة الطرد المركزي، وأجهزة المزج الدوامي، وغطاء التدفق الصفائحي، وأجهزة قياس التدفق الخلوي المزودة بقنوات فلورية مناسبة.
- يتطلب توحيد محاليل العمل من APF وبيروكسيد الهيدروجين عبر المختبرات لضمان الحصول على نتائج قابلة للتكرار.
- يتطلب التكيف مع الأنواع غير البشرية التحقق من تعبير البيروكسيداز وكفاءة صبغ APF في مجموعات فرعية محددة من الكريات البيضاء المستهدفة.
- يقتصر على الكشف عن نشاط البيروكسيداز المهلجن؛ ولا يقيس وظائف الكريات البيضاء الأخرى ما لم يتم دمجه مع فحوصات إضافية.
