تقييم سريع ومحدد من Halogenating البيروكسيد آخر في عينات الدم التخصيب خلايا الدم البيضاء
يوليو 28, 2016
يصف هذا البروتوكول التخصيب السريع للكريات البيض من عينات الدم الصغيرة لتحديد محدد لاحق لنشاط البيروكسيديز المهلوجني داخل الخلايا. يمكن تطبيق الطريقة على المواد البشرية وغير البشرية وقد تساهم في تقييم علامات الالتهابات الجديدة.
يتمثل الهدف العام لطريقة استنفاد كريات الدم الحمراء هذه في تحقيق إثراء سريع وبسيط لخلايا الدم البيضاء من عينة دم صغيرة. وتكمن العديد من مزايا هذه التقنية في كونها منخفضة التكلفة وموثوقة وسريعة. علاوة على ذلك، يمكن تطبيقها على عينات الدم البشرية وغير البشرية.
قبل البدء في إجراء عملية التحلل، اضبط الماصة المخصصة لإضافة الماء على 2 mL، والماصة المخصصة لمحلول PBS على 5 mL. ثم ضع دوارق مفتوحة من الماء ومحلول PBS تحت غطاء التدفق الصفائحي في درجة حرارة الغرفة. ونظراً لأن التحلل بنقص التوترية هو عملية حرجة زمنياً، فيجب تحضير كل شيء مسبقاً.
علاوة على ذلك، يجب تنفيذ إجراء التحلل دائمًا بنفس الطريقة لضمان الحصول على نتائج متوافقة. بعد ذلك، يتم نقل 100 µL من كل عينة دم إلى أنبوب مخروطي سعة 15 mL. ثم يُضاف 2 mL من الماء المقطر إلى كل عينة مع الرج باستخدام جهاز الـ vortex على الإعداد المتوسط.
اترك الخلايا لترتاح لمدة 60 ثانية، ثم أضف خمسة ملليلتر من PBS. واخلط العينات باستخدام جهاز vortexting. الآن، قم بتجميع الخلايا عن طريق الطرد المركزي، ثم تخلص من الرواسب العلوية بالصب.
اقلب الأنابيب واقرع الفتحات على منشفة ورقية لإزالة أكبر قدر ممكن من السائل. ثم كرر إجراء التحلل بنقص التوتر (hypotonic lysis) كما تم توضيحه للتو. وبعد الحصول على راسب جاف للمرة الثانية، أعد تعليق كل عينة في 500 µL من HBSS، حتى يتم الحصول على محلول متجانس.
وانقل الخلايا إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 milliliter على الثلج. وللتحقق من خصوصية البيروكسيداز في العينات بعد صبغها بـ amino phenol fluorescein أو APF، أضف أولاً خمسة µL من مثبط heme peroxidase، وهو 4-ABAH، إلى العينات المناسبة مع التحضين لمدة 15 دقيقة عند 37 °C. بعد ذلك، أضف خمسة µL من محلول APF العامل إلى كل أنبوب، وقم برج الخلايا بلطف باستخدام جهاز vortex على الإعداد المتوسط.
يتم تحضين جميع العينات عند 37 °C لمدة 30 دقيقة. ثم يُضاف 5 µL من محلول بيروكسيد الهيدروجين العامل إلى كل عينة، مع رج الأنابيب برفق باستخدام جهاز Vortex. وبعد مرور 60 دقيقة عند 37 °C، تُطرد الخلايا مركزياً، ثم يُزال السائل الطافي بعناية دون تعريض الرواسب للاضطراب.
أخيرًا، أعد تعليق الخلايا في 250 µL من HBSS، واحفظ العينات في الظلام حتى يتم تحليلها، وذلك لتجنب التبييض الضوئي. يظهر هنا مثال تمثيلي لمجموعات الكريات البيضاء بعد التحلل ناقص التوتر والصبغ بـ APF كما تم توضيحه للتو. ومن خلال رسم حجم الخلية مقابل الحبيبية، يمكن ملاحظة الاستنفاد القوي للكريات الحمراء، حيث شكلت مجموعة خلايا الدم الحمراء والحطام 22% فقط من الأحداث.
علاوة على ذلك، يسهل توزيع شدة الفلورة المشتقة من APF تمييزاً واضحاً لكريات الدم الحمراء والخلايا اللمفاوية السلبية لبيروكسيداز، بينما لوحظ أكسدة متوسطة لـ APF في الخلايا الوحيدة والخلايا الحمضية الموجبة لبيروكسيداز، وأظهرت الخلايا المتعادلة أكسدة قوية لبيروكسيداز. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تطبيقها على ما يصل إلى 50 عينة دم بالتوازي إذا نُفذت بشكل صحيح. وبعد هذا الإجراء، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الصبغ بالأجسام المضادة لتحديد المجموعات الفرعية للخلايا المراد دراستها.
بعد تطوير هذه التقنية، مهدت الطريق للباحثين في مجال دراسات الحيوانات الصغيرة لاستكشاف دور نشاط الهلجنة لـ MPO و EPO في النماذج الحيوانية للأمراض الالتهابية المزمنة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يصف هذا البروتوكول طريقة سريعة وبسيطة لإثراء الكريات البيضاء من عينات دم صغيرة، وهي قابلة للتطبيق على المواد البشرية وغير البشرية على حد سواء. وتتميز هذه التقنية بكونها موفرة للتكلفة وموثوقة، مما يسهل عملية تقييم المؤشرات الالتهابية الجديدة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- علم المناعة
- بيولوجيا الخلية
خلفية علمية
- يعد إثراء الكريات البيضاء أمراً بالغ الأهمية لدراسة الاستجابات المناعية.
- يمكن أن تكون الطرق التقليدية مستهلكة للوقت ومعقدة.
- تهدف هذه الطريقة إلى تبسيط هذه العملية.
- يمكن استخدامها لعينات الدم البشرية وغير البشرية على حد سواء.
الغرض من الدراسة
- تطوير بروتوكول سريع لإثراء الكريات البيضاء.
- تقييم نشاط بيروكسيداز الهالوجين في الكريات البيضاء.
- المساهمة في تحديد العلامات الالتهابية.
الطرق المستخدمة
- تجهيز الماصّات لإعطاء الماء ومحلول PBS.
- استخدام غطاء التدفق الصفائحي لمعالجة العينات.
- التحلل ناقص التوتر لإزالة كريات الدم الحمراء.
- التنفيذ الدقيق لإجراء التحلل مع مراعاة عامل الوقت.
النتائج الرئيسية
- إثراء ناجح لخلايا الكريات البيضاء من عينات دم صغيرة.
- تقييم موثوق لنشاط بيروكسيديز.
- إمكانية التطبيق على العينات البشرية وغير البشرية على حد سواء.
- إمكانية تقييم علامات التهابية جديدة.
الاستنتاجات
- تتميز هذه الطريقة بالكفاءة والفعالية من حيث التكلفة.
- تعمل هذه الطريقة على تعزيز دراسة الاستجابات المناعية.
- يمكن للأبحاث المستقبلية أن تستند إلى هذا البروتوكول.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح هذا البروتوكول إثراءً سريعاً ومعياريًا للخلايا البيضاء من عينات دم صغيرة، مما يدعم جهود الاكتشاف المبكر في أبحاث الأمراض الالتهابية. ومن خلال قياس نشاط بيروكسيديز الهالوجين الخاص بـ MPO و EPO، يوفر هذا البروتوكول قراءة ميكانيكية للتحقق من الأهداف وتقليل المخاطر المرتبطة بالمسارات الحيوية. كما تسهل توافقية هذه الطريقة مع قياس التدفق الخلوي والصبغ بالأجسام المضادة دمجها في سير عمل الفحص والبحوث الانتقالية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير للصناعات الدوائية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء نشاط بيروكسيداز الخاص بكريات الدم البيضاء للتحقق من صحة MPO و EPO كأهداف علاجية في الالتهاب المزمن.
- القيمة التشغيلية: تستخدم حجماً أدنى من العينة (50–100 µL)، مما يسمح بأخذ عينات متكررة من نماذج الحيوانات الصغيرة لإجراء دراسات طولية حول ارتباط الهدف.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يجمع بين صبغ APF وقياس التدفق الخلوي لإنتاج قراءات كمية تعتمد على الفلورة لإنتاج HOCl/HOBr بغرض توحيد معايير المقايسة.
- القيمة التشغيلية: يتيح المعالجة عالية الإنتاجية لما يصل إلى 50 عينة بالتوازي، مما يدعم حملات الفرز القابلة للتوسع.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: تربط نشاط بيروكسيداز الكريات البيضاء بالعمليات الالتهابية ذات الصلة بالمرض، مما يدعم مواءمة المؤشرات الحيوية في النماذج قبل السريرية.
- القيمة التشغيلية: تعمل مع دماء البشر والقوارض على حد سواء، مما يتيح الاستمرارية الانتقالية بين الأنواع في التحقق من الأهداف.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن تسلسل عملية الاكتشاف، بدءاً من الاختبارات المبكرة لفرضيات الأهداف وصولاً إلى التحقق من الصلاحية في المرحلة ما قبل السريرية، ولا سيما في برامج المناعة والأمراض الالتهابية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات من خلال قياس نشاط بيروكسيداز النوعي للإنزيم في تجمعات كريات الدم البيضاء المنقاة.
- الفحص: توفر مخرجات كمية قابلة للتكرار عبر فلورة APF وقياس التدفق الخلوي، مما يتيح تقييم تأثير المركبات على نشاط البيروكسيداز.
- التحليلات: تولد بيانات قابلة للقياس لشدة الفلورة تسمح بمقارنة المجموعات الفرعية من الخلايا الموجبة للبيروكسيداز (العدلات، والخلايا الوحيدة، والخلايا الحمضية) تحت الظروف التجريبية.
- الأبحاث الانتقالية: تربط نشاط البيروكسيداز بآليات الأمراض الالتهابية، مما يدعم الاستمرارية قبل السريرية عند دمجها مع صبغ علامات سطح الخلية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يشكل إثراء كريات الدم البيضاء الموحد والكشف القائم على APF منصة قابلة لإعادة الاستخدام لبرامج أهداف التهابية متعددة.
الأثر التشغيلي وأثر المؤسسة
- القيمة العلمية: توفر ثقة تنبؤية في التحقق من الهدف عن طريق عزل نشاط البيروكسيداز في سلالات محددة من الكريات البيضاء.
- القيمة التشغيلية: توفر بروتوكولاً سريعاً ومنخفض التكلفة يتطلب الحد الأدنى من الأجهزة (جهاز طرد مركزي، وجهاز مزج دوامي، وجهاز قياس التدفق الخلوي).
- القيمة الاستراتيجية: تقلل الجداول الزمنية لتقليل المخاطر البيولوجية من خلال تمكين التقييم السريع والمتكرر لتعديل الهدف في عينات الكريات البيضاء.
- التأثير على المحفظة: تدعم تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر لمثبطات MPO/EPO من خلال تقديم بيانات مبكرة عن النشاط الوظيفي من خلايا ذات صلة فسيولوجياً.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في التعامل مع الكريات البيضاء، وقياس التدفق الخلوي، وكيمياء المسابير الفلورية.
- يعتمد على توفر أجهزة الطرد المركزي، وأجهزة المزج الدوامي، وغطاء التدفق الصفائحي، وأجهزة قياس التدفق الخلوي المزودة بقنوات فلورية مناسبة.
- يتطلب توحيد محاليل العمل من APF وبيروكسيد الهيدروجين عبر المختبرات لضمان الحصول على نتائج قابلة للتكرار.
- يتطلب التكيف مع الأنواع غير البشرية التحقق من تعبير البيروكسيداز وكفاءة صبغ APF في مجموعات فرعية محددة من الكريات البيضاء المستهدفة.
- يقتصر على الكشف عن نشاط البيروكسيداز المهلجن؛ ولا يقيس وظائف الكريات البيضاء الأخرى ما لم يتم دمجه مع فحوصات إضافية.
