طرق تقدير من معدلات الجلوكوز والأحماض الدهنية الأكسدة في عزل قلب الجرذ العمل

الهدف العام من هذا الإجراء هو الحصول على قياسات آنية متزامنة لمعدلات أكسدة الجلوكوز وأكسدة الأحماض الدهنية في عضلة القلب، بالإضافة إلى الوظيفة الانقباضية القلبية في قلب جرذ منعزل يعمل. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال القلب والأوعية الدموية، مثل كيفية تكيف القلب أيضياً مع التغيرات الحادة في متطلبات الطاقة، وكيفية تأثر هذه الاستجابات في الحالات المرضية.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تمنح الباحث تحكماً كاملاً في المتغيرات البيئية، مثل طبيعة وتركيزات الركائز أو العقاقير أو الهرمونات التي يتم إيصالها إلى القلب. سيقوم بإجراء هذه الخطوات Bhavisha Bakrania، زميلة ما بعد الدكتوراه من مركز أبحاث القلب والأوعية الدموية والكلى في المركز الطبي بجامعة ميسيسيبي. للبدء، قم بتشغيل المضخة لتهيئة جهاز التروية وأكسجة المحلول المنظم.

بعد تحضير المواد، قم بتخدير الجرذ وتجهيزه للجراحة. قم بقص شعر البطن وإجراء شق طولي في المنتصف مع تمديد جانبي. أزِح المعدة والأمعاء جانبًا للوصول إلى الوريد الأجوف السفلي وحقن 200 USP units من Heparin.

انتظر من 5 إلى 10 ثوانٍ، ثم استخدم المقص لقص الحجاب الحاجز وجوانب القفص الصدري للكشف عن محتويات التجويف الصدري. بعد ذلك، أمسك القلب برفق باستخدام اليد واستأصل القلب والرئتين معاً. قم بالقص عند مستوى الأبهر النازل، مع الحرص على عدم إتلاف قوس الأبهر والأبهر الصاعد أثناء هذه العملية.

انقل القلب والرئتين فوراً إلى طبق تشريح مملوء بمحلول KH المنظم البارد جداً. بعد توقف القلب عن النبض، تعلّم العمل بسرعة حتى يمكن إعادة تشغيله خلال دقيقة أو دقيقتين. الآن، اغمر القلب والرئتين في طبق جديد من محلول KH المنظم البارد جداً.

قم بقص أي قطع كبيرة من أنسجة الرئة بسرعة، ثم اقطع الأبهر النازل فوق قوس الأبهر مباشرةً. بالنسبة للخطوات التالية، اتخذ الاحتياطات اللازمة عند التعامل مع المواد المشعة. بعد ذلك، استخدم الملقط لفتح الأبهر بعناية وادفع القلب للأعلى فوق القنية.

توخَّ الحذر الشديد لضمان عدم تجاوز المسار الأبهرِيّ باستخدام الكانيولا، حيث قد يؤدي ذلك إلى نقص تروية القلب وإتلاف الصمامات الأبهرية. الآن، ثبِّت الوصلة باستخدام مشبك دقيق (micro clip) وابدأ عملية تروية القلب بطريقة لاجيندورف (Lagendorff perfusion). دون استعجال، ثبِّت الأبهر بالكانيولا الأبهرية باستخدام خيط جراحي حريري 3 0، ثم أزل المشبك الدقيق.

بعد ذلك، حدد موقع الوريد الرئوي وقم بإزالة الأنسجة غير القلبية حسب الحاجة. اترك كمية كافية من الأنسجة لتثبيت الأذين الأيسر بالقنية. وتعد عملية قنطرة الأذين الأيسر ثاني أهم خطوة في البروتوكول، حيث إن الإدخال غير الصحيح للقنية أو وجود تسريب سيؤدي إلى إضعاف الانقباضات والتأثير سلباً على تقدير معدلات الأيض.

بعد ذلك، قم بتجهيز كانيولا الخط الأذيني الأيسر، تماماً كما فعلت مع الكانيولا اليمنى. ثم باستخدام الملقط، أمسك فتحة الوريد الرئوي بدقة وقم بإزاحة القلب للأعلى فوق كانيولا الأذين. حرك الأنسجة حسب الحاجة دون ثني الشريان الأبهر أو إجهاد القلب بشكل مفرط.

ثم قم بتثبيت الكانيولا باستخدام خيط حريري 3 0. وأخيراً، افتح خط الأذين مع تحويل خط الأبهر في الوقت ذاته إلى وضع التشغيل. وفي حال تسرب المحلول المنظم من الأذين الأيسر، أغلق خط الأذين وأعد التحويل إلى وضع لاجيندورف (Lagendorff).

ثم استخدم المزيد من الغرز لتثبيت القنية بشكل أفضل وحاول الانتقال إلى وضع التشغيل مرة أخرى. إذا كانت التجربة تتضمن قياساً مباشراً لوظيفة LV باستخدام قسطرة، فابدأ بثقب قمة LV باستخدام إبرة عيار 26، ثم أدخل قسطرة قياس الضغط والحجم وقم بمحاذاة العمود مع المحور الطولي لـ LV. بعد ذلك، ضع القطب البعيد E1 أسفل الصمام الأبهري مباشرة، بجوار حدود الشغاف، وضع القطب القريب E4 داخل جدار البطين مباشرة.

قم الآن بتثبيت القلب في غرفة ذات غلاف مائي. ثم ابدأ بمراقبة المعلمات الوظيفية في البرنامج. وبمجرد استقرار المعلمات المرجعية لمدة خمس دقائق على الأقل، ابدأ في تسجيل البيانات.

لقياس التدفق التاجي، قم بتسجيل الوقت المستغرق لجمع 20 milliliters من السائل الناضح. بعد ذلك، اسحب مليمتيرين من السائل الناضح في سرنجة عبر صمام إيقاف ثلاثي الاتجاهات وتخلص من الكمية المتبقية. انقل عينة المليمتيرين فوراً إلى أنبوب طرد مركزي دقيق، ثم خذ جزءاً بحجم نصف مليمتير لتحديد معدل أكسدة الجلوكوز.

قم بتخزين المتبقي على الثلج. استمر في أخذ عينات من التدفق التاجي بشكل دوري، وقبل الانتهاء، احقن 10 µL من المحلول الملحي عالي التوتر في الخط الأذيني، مباشرة قبل وصوله إلى القنية.

استخدم الاستجابة لهذه الجرعة الوريدية (bolus) لحساب الموصلية المتوازية (parallel conductance) من أجل التحديد الدقيق لحجم القلب. بعد ذلك، قم بفك إغلاق حجرة القلب وإزالة القسطرة من البطين الأيسر (LV). ثم اقطع القلب بعيداً عن القنيات وضعه في محلول KH المنظم المبرد بالثلج. الآن، جفف القلب بسرعة باستخدام منشفة ورقية وقم بقياس وزنه الرطب.

بمجرد الانتهاء من عملية الوزن، ابدأ في تشريح عينات الأنسجة المطلوبة، ثم جمد الأنسجة المتبقية باستخدام ملاقط مبردة على الثلج الجاف. وفي مرحلة التحضير، املأ قوارير الوميض الزجاجية بكمية 1 mL من hyamine hydroxide بتركيز 10x. قم بتحضير قارورة واحدة لكل عينة من تدفق الشرايين التاجية وقارورتين لعينات الضبط.

بمجرد تحميل قارورة العينة، ضعها مباشرة في قارورة وميض محملة. ولإجراء التحليل، قم بتغطية القارورة بعناية بسدادة غشائية مطاطية واستخدم شريط البارافيلم (parafilm) لإحكام غلق القارورة. الآن، وباستخدام سرنجة سعة 1 mL مع إبرة طويلة من عيار 23 gauge، احقن 200 µL من حمض البيركلوريك بتركيز 60% عبر الغشاء المطاطي.

اترك جميع قوارير العينات لتبقى طوال الليل. وفي اليوم التالي، استخرج كل أنبوب عينة بعناية باستخدام ملقط واغسل قاعدتها فوق القوارير المفتوحة باستخدام 1 mL من مزيج الوميض (scintillation cocktail) لاستعادة كل هيدروكسيد الهيامين. ثم أضف 9 mL إضافية من مزيج الوميض إلى كل قارورة.

للحصول على النشاط النوعي، أضف 0.5 milliliters من محلول التخفيف (profusion buffer) إلى اثنتين من القوارير. الآن، رُج القوارير بقوة واترك القارورة تستقر لمدة ست ساعات على الأقل قبل إجراء القياسات. ولتحديد معدلات أكسدة الأوليات في عضلة القلب، قم أولاً بتجهيز عمود راتنج التبادل الأنيوني لكل عينة.

قم بتعبئة أطراف أنابيب محاقن سعة 3 mL بالصوف الزجاجي. ثم أضف ملاط الراتنج المائي حتى علامة 2 mL في كل عمود باستخدام ماصة نقل. بعد ذلك، اغسل الراتنج بتمرير 2 mL من الماء فائق النقاء عبر كل عمود ثلاث مرات.

بعد ذلك، ضع قوارير الوميض تحت الأعمدة وقم بتحميل الأعمدة بنصف ملليلتر من التدفق الشرياني التاجي. وبالنسبة لقياس الخلفية، استخدم محلول التروية المنظم بدلاً من ذلك. والآن، استخلص محتويات الأعمدة بالتتابع باستخدام نصف ملليلتر، ثم ملليلتر واحد، وأخيراً ملليلترين من الماء عالي النقاء.

تخلص من الأعمدة. ثم أضف 13 milliliters من وميض التلوين (scintillation cocktail) إلى القوارير. أضف 0.5 milliliters من محلول التروية المنظم (perfusion buffer) مباشرة إلى قارورتين مملوئتين بـ 13 milliliters من وميض التلوين السائل لتقدير النشاط النوعي.

رُجّ القوارير بقوة، واتركها لتستقر لمدة ست ساعات أو أكثر ثم قم بإجراء القياسات. تم عزل القلوب من جرذين بعمر 16 أسبوعاً وتعريضها لظروف إجهاد مختلفة. وبالنسبة لأحد القلوب، تمت محاكاة زيادة حادة في عبء العمل عن طريق زيادة الحمل البعدي بنسبة 40% وإضافة الإبينفرين إلى محلول التروية المنظم.

ارتفع معدل ضربات القلب فوراً بنسبة تزيد عن 50% مع تحفيز القفزة في الشغل. وزادت القدرة القلبية بنسبة تزيد عن 40% عند القفزة في الشغل، وهو ما صاحبه زيادة في معدلات أكسدة كل من الجلوكوز والأوليات. وكانت الزيادة النسبية في أكسدة الجلوكوز مقارنة بالخط القاعدي ملحوظة.

خضع القلب الآخر لـ 15 دقيقة من نقص التروية الشامل و 30 دقيقة من إعادة التروية. وتحت هذه الظروف التجريبية، استعيد ضغط نبضي قريب من الطبيعي بعد بضع دقائق من بدء إعادة التروية. وخلال 10 دقائق، زادت القدرة القلبية بسرعة لتتجاوز قيم ما قبل نقص التروية قبل أن تعود إلى قيم قريبة من خط الأساس.

نتج ذلك عن زيادة أكسدة الأوليات. بينما استعاد أكسدة الجلوكوز نشاطه بسرعة ليعود إلى مستويات ما قبل نقص التروية. وبمجرد إتقان العملية، يمكن إجراء عزل القلب وصولاً إلى إعادة التروية الأولية في وضع التشغيل في أقل من خمس دقائق إذا نُفذت بشكل صحيح.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تطبيق طرق أخرى مثل تحليلات التعبير عن RNA والبروتينات للإجابة على أسئلة إضافية، مثل تأثير عقار معين أو حالة إجهاد على مسارات التأشير الجزيئية. ولا تنسَ أن العمل مع الكاشفات المشعة قد يكون خطيراً للغاية، لذا يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة، مثل ارتداء معدات الوقاية الشخصية الكاملة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.