يقترن تصوير البروتين G مستقبلات بوساطة الكيميائي والأحداث يشير في خلايا HL60 العدلات مثل

المقايسات الكيميائي البصرية ضرورية لفهم أفضل لكيفية الخلايا حقيقية النواة التحكم بوساطة جاذب كيميائي الاتجاه الهجرة الخلية. هنا، نحن تصف الأساليب التفصيلية ل: 1) في الوقت الحقيقي، وارتفاع القرار، رصد المقايسات الكيميائي متعددة، و2) تصور في وقت واحد التدرج جاذب كيميائي وديناميات الزمانية المكانية من الإشارات الأحداث في الخلايا HL60 مثل العدلات.

الهدف العام لهذا النموذج هو السماح بالمراقبة المتزامنة لمقايسات الانجذاب الكيميائي المتعددة ، أو تصور أحداث الإشارات المتعددة لخلية كيميائية واحدة. طور علماء الأحياء الخلوية في Overdeck العديد من الأساليب المختلفة لتحديد سلوك الانجذاب الكيميائي للخلايا. حتى وقت قريب ، كنا قادرين على الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الانجذاب الكيميائي ، مثل كيفية مراقبة فحوصات الانجذاب الكيميائي المتعددة في وقت واحد.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في تطبيق مبدأ الموائع الدقيقة لتوليد مكونات قابلة للتكرار وموثوقة للغاية لمقايسات الانجذاب الكيميائي المتزامنة المتعددة بدقة عالية في الوقت الفعلي. سيوضح الإجراء الدكتور شي وين ، وهو باحث ما بعد الدكتوراه من مختبرنا. لتجميع الحامل ، استخدم الرافعات أولا لوضع القاعدة في الوضع الرأسي بحيث يمكن إمالة الرافعات نحو المستخدم.

بعد ذلك ، قم بتغطية سطح الزجاج 41 ملم لفترة وجيزة بنسبة 70٪ من الإيثانول ، واستخدم منديلا لإزالة الإيثانول بعناية. أدخل الزجاج في قاعدة الحامل ، وضع زلة غطاء مربعة مطلية بحجم 2 ملم فوق الزجاج. بعد ذلك ، أدخل الحلقة O الصغيرة في الجزء السفلي من مبيت الرقاقة ، وقم بتركيب مبيت الرقاقة في قاعدة الحامل ، مع وجود فتحة بيضاوية الشكل في الجزء الخلفي من الجهاز.

اسحب المستوى الداخلي لقاعدة الحامل للأمام إلى الوضع الأفقي ، لقفل مبيت الرقاقة في مكانه. استخدم منفضة الهواء لتفجير أي حطام من داخل مبيت الرقاقة. ثم أضف 4 مليليات من وسط RPMI 1640 ، مكملة بنسبة 0.1٪ BSA ، إلى السكن.

الآن ، قم بتركيب شريحة جهاز تحليل حركة الخلية المطلية BSA في وسط مبيت الرقاقة مع الوجه الهيكلي الملامس للزجاج ، ومع علامة تحديد المواقع في الخلف. ضع النتوءين على الحشية المطاطية في الفتحات لتثبيت الحشية في الجزء السفلي من مشبك الرقاقة ، وقم بتركيب الحلقة O الكبيرة على الجزء العلوي من مبيت الرقاقة. ثم قم بتركيب مشبك الرقاقة مع فتحة المستشعر في الخلف واسحب الرافعة الخارجية لقاعدة الإسكان للأمام إلى الوضع الأفقي لقفل مشبك الرقاقة في مكانه.

عندما يتم تجميع الحامل ، ضع الجزء السفلي من الحامل على صندوق ضوئي للتأكد من عدم وجود فقاعات هواء في الآبار. ثم قم بإزالة الغطاء ، وانقل المجموعة إلى اللوحة الموجودة أعلى وحدة جهاز تحليل حركة الخلية ، وقم بتوصيل كتلة المستشعر بالحامل. لإجراء مقايسة حركة الخلية ، نقوم أولا بتعليق خلايا HL60 المتمايزة في وسط RPMI 1640 المكملة BSA ، و مرتين في عشرة إلى الخلايا السادسة لكل تركيز مليلتر.

بعد ذلك ، قم بتوصيل وحدة جهاز تحليل تنقل الخلية بالكمبيوتر للحصول على الصورة ، وقم بتشغيل كلا الجهازين. بعد ذلك ، افتح برنامج جهاز تحليل حركة الخلية. في لوحة التحكم في صورة الكاميرا، استخدم الخطوط الأفقية والرأسية لضبط موضع الحامل في الوقت الفعلي، وقم بتوسيط الجهاز في لوحة صورة الكاميرا.

ثم حدد القناة الأولى لنقل الكاميرا إلى القناة المحددة، واستخدم تحريك اليسار من التحرك لليمين لضبط إحداثيات X للكاميرا لتوسيط مجال الرؤية أفقيا. لضبط الصورة رأسيا على منتصف الشاشة ، أدر مقبض الموضع على اللوحة الأمامية لجهاز تحليل حركة الخلية. في لوحة التحكم في السخان ، اضبط درجة حرارة الحامل على 37 درجة مئوية ، ودرجة حرارة اللوحة على 39 درجة مئوية.

للتحكم في درجة الحرارة باستخدام المستشعر الحراري المتصل بالحامل، انقر فوق الحرارة لبدء التسخين، ثم فوق أنبوب التسخين. في لوحة التصوير، أدخل 15 ثانية للفاصل الزمني و30 دقيقة للوقت لتعيين الفواصل الزمنية ومدة مقايسة الانجذاب الكيميائي، على التوالي. لأغراض السلامة، حدد إيقاف تشغيل السخان في نهاية صندوق التصوير.

بعد ذلك ، احفظ الملف ، وأدخل تفاصيل التجربة في لوحة المذكرة ، وتأكد من أن الجهاز قد تم توسيطه في جميع القنوات. الآن قم بإزالة كل المخزن المؤقت من الحامل ، وثمانية ميكرولترات من المخزن المؤقت من البئر الثالث من أعلى القناة الأولى. باستخدام حقنة ، قم بحقن ميكرولترين من الخلايا في البئر الثاني في نفس القناة ، مع مراقبة الشاشة في الوقت الفعلي للتحكم في عدد الخلية وتدفقها أثناء الحقن.

عندما تتم محاذاة الخلايا ، أضف على الفور ثمانية ميكرولترات من المخزن المؤقت إلى البئر ، وكرر حقن الخلية في القنوات من اثنين إلى ستة ، كما هو موضح للتو. بعد إضافة جميع الخلايا ، أضف ملليلترين من المخزن المؤقت مرة أخرى إلى الحامل ، وأضف ميكرولتر واحد من الجاذب الكيميائي إلى البئر الثالث من الأعلى في القنوات المناسبة. أخيرا ، ابدأ الحصول على الصورة.

في هذه التجربة التمثيلية ، تبدأ خلايا HL60 في التصنيع الكيميائي في مسار مستقيم فور حقن الجاذب الكيميائي ، واستمرت لمدة 60 دقيقة كاملة من الفحص ، بما يتفق مع نتائج محاكاة استقرار التدرج. يسمح تتبع مسار السفر ومورفولوجيا الخلايا بالقياس الكمي والمقارنة اللاحقة لسلوكيات الانجذاب الكيميائي ، باستخدام مؤشر الانجذاب الكيميائي الذي يتضمن إجمالي طول المسار واتجاهها وسرعتها واستدارتها للخلايا. يسمح تطبيق صبغة الفلورسنت ، جنبا إلى جنب مع الجاذب الكيميائي ، بإنشاء علاقة خطية بين تركيز الجاذب الكيميائي ، وشدة الصبغة الفلورية المراقبة.

علاوة على ذلك ، استجابة لتحفيز الجاذب الكيميائي المطبق بشكل موحد ، تتوسط خلايا HL60 في نقل غشاء قوي لبروتين كيناز براعة GFP D1.In تدرج جاذب كيميائي ، تقوم خلايا HL60 بتجنيد كيناز بنشاط في الجزء الخلفي من الحافة الأمامية. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه العملية في 30 دقيقة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم اتباع تعليمات الشركة المصنعة بدقة بشأن مجموعة الحامل ، ومراقبة حقن الخلية.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الانجذاب الكيميائي لاستكشاف إمكانية إجراء فحوصات الانجذاب الكيميائي المتعددة ، مثل أحادية الجنس الديكتاتورية ، أو أنواع أخرى من أنظمة خلايا الثدييات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تجميع الوحدة ، أو إجراء فحوصات الانجذاب الكيميائي المتزامنة ، أو تصور أحداث إشارات متعددة في نفس الوقت في خلايا التصنيف الكيميائي.