في التحليل المتعمق الفسيولوجية لبالسكان خلية المعرفة في الحادة الأنسجة شرائح من الميكعي الجهاز ماوس

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء تحليل فيزيولوجي كهربائي لخلية واحدة من مجموعة محددة من العصبونات الحسية في شرائح نسيجية حادة من العضو الميكعي الأنفي للفأر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في توضيح أسئلة رئيسية في مجال التحسس الكيميائي، مثل آليات الكشف عن المواد الكيميائية. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنه من خلال التسجيل من العصبونات الحسية في شرائح نسيجية حادة، يمكن استقصاء هذه الخلايا في بيئتها الأصلية.

لبدء هذا الإجراء، بعد التضحية بالحيوان، قم بإزالة الفك السفلي عن طريق إدخال مقص جراحي كبير عبر تجويف الفم، وقطع عظام الفك السفلي والعضلات من كل جانب على حدة. بعد ذلك، قم بإزالة الجلد من الفك العلوي وحول طرف الأنف باستخدام ملقط متوسط الحجم، وذلك لتسهيل الوصول إلى القواطع. ثم استخدم مقص العظام لقطع الجزء الأكبر من القواطع بزاوية 45 درجة في الاتجاه المنقاري لتسهيل إزالة كبسولة VNO من التجويف الأنفي.

تجنب قطع جذر السن لمنع تلف طرف كبسولة VNO. بعد ذلك، أمسك الحنك العلوي الصلب من جزئه المنقاري باستخدام ملقط متوسط، وقم بتقشيره بعناية كقطعة واحدة بزاوية مسطحة. اشطف التجويف الأنفي بشكل متكرر باستخدام محلول S2 مبرد بالثلج. ثم استخدم مقصات نابضية دقيقة لقطع النضح العظمي بين طرف عظم الميكعة والفك.

أدخل طرفي المقص بحيث يكون الجزء المنحني موجهاً بعيداً عن العضو الأنفي الوعائي (VNO). وقم بقص العظم بعناية في خطوات صغيرة على كل من الجانبين الأيسر والأيمن، وبشكل جانبي بالنسبة لمحفظة العضو الأنفي الوعائي (VNO). ولإزالة محفظة العضو الأنفي الوعائي (VNO)، قم بالقص عبر عظم الميكعة في الجزء الذيلي، ثم ارفع عظم الميكعة بعناية خارج التجويف الأنفي باستخدام ملاقط متوسطة الحجم.

انقل العضو الأنفي الميكعي (VNO) فوراً إلى طبق بتري صغير تحت مجهر ستيريو موضوع على حزمة جل مبردة، حيث يتم تنفيذ الخطوات المتبقية من عملية التشريح. بعد ذلك، اشطف العضو الأنفي الميكعي بكمية صغيرة من محلول S2 المبرد بالثلج لمنع جفاف الأنسجة. ثم افصل المحافظ الغضروفية التي تحتوي على الأنسجة الرخوة للعضو الأنفي الميكعي عن طريق الإمساك بالجزء الخلفي من العظم الميكعي باستخدام ملقط متوسط.

لتحقيق ذلك، ضع المحفظة في وضعية تسمح برؤيتها من الناحية الظهرية بحيث يصبح الانقسام بين العضوين الميكعيين الأنفيين (VNOs) مرئياً. استخدم طرف ملقط دقيق لفصل كلتا محفظتي الغضروف للعضو الميكعي الأنفي عن العظم المركزي، مع إبقاء عظم الميكعة مثبتاً عند الجزء الخلفي. تأكد من إزالة الجدار الغضروفي الإنسي الذي كان متصلاً سابقاً بعظم الميكعة.

عند إزالة الغضروف المحيط بالعضو الأنفي الموريني (VNO)، استخدم الملاقط فقط عند حافة المحفظة الغضروفية. وتوخَّ الحذر الشديد لتجنب إتلاف الظهارة الحسية الرقيقة. ولإزالة ما تبقى من الغضروف، أدر الـ VNO بحيث يكون جانبه الجانبي المنحني في قاع الطبق، وثبّت الغضروف بإحكام من أحد الجانبين باستخدام الملاقط.

بعد ذلك، حرك الملقط الدقيق الثاني بحذر من الجانب الخلفي بزاوية مسطحة للغاية بين الغضروف والعضو الأنفي المقطعي (VNO) لإرخاء الاتصال بين النسيج والغضروف. ولتجنب إتلاف الظهارة الحسية، قم بتقشير الـ VNO ببطء بعيداً عن الغضروف عن طريق إمساكه من طرفه الذيلي. وبمجرد رفع الـ VNO من المحفظة، قم بإزالة جميع أجزاء الغضروف الصغيرة المتبقية، حيث إن أي قطع غضروفية متبقية ستؤدي إلى انفصال النسيج عن الآجاروز المحيط به أثناء عملية التقطيع.

بعد ذلك، ضع قطرة صغيرة من S2 المبردة على أول VNO تم تشريحه لمنع تلف الأنسجة. ولتضمين الـ VNOs، املأ كلا الطبقين الصغيرين من بتري حتى الحافة بـ S3 المذاب. بعد ذلك، اغمر كل VNO في الأجاروز وحركه أفقياً ذهاباً وإياباً عدة مرات لإزالة غشاء المحلول خارج الخلوي بالإضافة إلى أي فقاعات هواء من سطحه. ضع الـ VNO عمودياً، بحيث تكون الطرف المنقاري مواجهاً لقاع الطبق.

بعد ذلك، ضع كلا الطبقين على عبوة ثلج هلامية، وانتظر حتى يتصلب الأجاروز. لا تقم بتغيير اتجاه العضو الأنفي المورّي (VNO) بمجرد أن يبدأ الأجاروز في التصلب، لأن ذلك سيؤدي إلى انفصال النسيج عن الأجاروز المحيط به. في هذا الإجراء، استخدم ملعقة صغيرة لنقل كتلة الأجاروز من الطبق الصغير إلى غطاء طبق بتري كبير، ثم اقلب الأجاروز رأساً على عقب، بحيث تظل القمة المنقارية لـ VNO متجهة للأعلى.

بعد ذلك، قم بقص الكتلة على شكل هرمي باستخدام مشرط جراحي، مع الحرص على عدم إتلاف النسيج المغمور. ثم استخدم الغراء الفائق (super glue) لتثبيت الكتلة ذات الشكل الهرمي في مركز لوحة العينات بجهاز المقطاع الاهتزازي (vibratome). وانتظر لمدة دقيقة واحدة تقريباً حتى يجف الغراء تماماً.

قم بتقطيع العينة إلى شرائح يتراوح سمكها بين 150 إلى 200 micrometer. افحص مورفولوجيا الشريحة سريعاً باستخدام المجهر التشريحي. ثم انقل جميع الشرائح إلى غرفة الأكسجة حتى وقت الاستخدام.

في هذه الخطوة، انقل شريحة من العصب الأنفي الثلاثي التوائم (VNO) إلى غرفة التصوير وثبّت موضع الشريحة باستخدام مرساة من الفولاذ المقاوم للصدأ مربوطة بألياف اصطناعية بسمك 0.1 mm. تجنب تغطية شريحة النسيج بأي من خيوط الألياف الاصطناعية. بعد ذلك، انقل غرفة التصوير إلى جهاز التسجيل وقم بتروية الشريحة باستمرار بمحلول S2 المؤكسج في درجة حرارة الغرفة.

اضبط الشعيرة الماصة عند سطح المحلول لضمان تبادل مستمر لمحلول الحمام. بعد ذلك، اضبط قلم التروية متعدد الفوهات (ثمانية في واحد) فوق الجزء غير الحسي من شريحة العضو الأنفي vomeronasal (VNO) الذي يحتوي على الوعاء الدموي وبشكل قريب منه. ثم قم بتوصيل القطب المرجعي بمحلول الحمام باستخدام جسر آجار على شكل حرف L مملوء بـ 150 millimolar من كلوريد البوتاسيوم.

بعد ذلك، املأ ماصة الرقعة (patch pipette) بمحلول الماصة S4. ثبّت الماصة فوق القطب المغطى بكلوريد الفضة المتصل بمرحلة الرأس (head stage) دون كشط الطبقة المغطاة، وقم بتثبيتها بإحكام. ثم قم بتطبيق ضغط إيجابي طفيف على ماصة الرقعة قبل إدخالها في الحمام. راقب الماصة وتأكد من أن مقاومتها تتراوح بين 4 megaohms و 10 megaohms.

قم بتصوير شريحة الـ VNO باستخدام كاميرا CCD عبر تقنية DIC المحسنة للأشعة تحت الحمراء، وحدد الخلايا التي تعبر عن FPR-rs3 i-Venus أو العصبونات الموصومة بشكل مماثل باستخدام الإضاءة الفلورية ومكعب ترشيح مناسب. اقترب من جسم الخلية باستخدام العجلات اليدوية لتحقيق أقصى قدر من الحساسية. وبسبب الضغط الموجب، سيظهر انبعاج صغير في غشاء جسم الخلية بمجرد اقتراب طرف الماصة.

بعد ذلك، قم بتحرير الضغط الإيجابي وتطبيق ضغط سلبي طفيف لسحب غشاء الخلية من أجل الحصول على سدادة عالية المقاومة تتراوح من 1 إلى 20 gigaohms. لاحقاً، طبق عملية شفط قصيرة ولطيفة لتمزيق غشاء الخلية وتأسيس تكوين الخلية الكاملة. تظهر في هذا الشكل صورة مجهرية بؤرية لقطاع نسيجي إكليلي من الـ VNO توزيع العصبونات الموجبة لـ FPR-rs3 Tau Venus الفلورية في الظهارة الحسية للعضو الميكعي الأنفي.

تظهر العصبونات الإيجابية لـ FPR-rs3 Tau Venus شجيرة راسمة قمية واحدة تنتهي ببنية تشبه النتوء عند الحدود التجويفية. وموضح هنا تسجيلات تثبيت الرقعة للخلية الكاملة التي أُجريت من جسم العصبونات VSN. وفيما يلي الآثار التمثيلية لتسجيلات تثبيت الرقعة للخلية الكاملة لتيار صوديوم سريع التنشيط وحساس لـ TTX في العصبونات VSN الإيجابية لـ FPR-rs3.

تكشف تسجيلات خطوة الجهد في ظل الظروف الضابطة عن تيار داخلي سريع وعابر يعتمد على الجهد. ويؤدي العلاج بـ TTX بتركيز 1 µM إلى تقليل هذا التيار بشكل كبير. ويظهر الأثر المطروح رقمياً المعروض هنا تيار الصوديوم المبوب بالجهد والحساس لـ TTX.

تظهر آثار تثبيت التيار التمثيلية حالة إزالة الاستقطاب وفرط الاستقطاب وسلاسل من جهود الفعل المتولدة عند حقن تيار موجب وسالب تدريجياً. وبمجرد إتقان هذه العملية، يمكن إتمام عملية التشريح وتقطيع الأنسجة بالكامل في غضون ساعة واحدة تقريباً لكلا العضوين الأنفيين vomeronasal (VNOs). وبعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل تسجيلات الرقعة الرخوة خارج الخلوية أو تصوير الكالسيوم من أجل زيادة الإنتاجية عند تحليل مجموعات أكبر من العصبونات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير شرائح نسيجية حادة من العضو الميكعي الأنفي في الفم، وكيفية إجراء تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربائية للخلية الواحدة من العصبونات الحسية الميكعية الأنفية.