في التحليل المتعمق الفسيولوجية لبالسكان خلية المعرفة في الحادة الأنسجة شرائح من الميكعي الجهاز ماوس

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء تحليل كهربية فسيولوجية أحادية الخلية لمجموعة محددة من الخلايا العصبية الحسية في شرائح الأنسجة الحادة من عضو الفأر الصوتي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في توضيح الأسئلة الرئيسية في مجال التحفيز الكيميائي ، مثل آليات الكشف عن المواد الكيميائية التي لا ترى أي شيء. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه من خلال التسجيل من الخلايا العصبية الحسية في شرائح الأنسجة الحادة ، يمكن فحص هذه الخلايا في بيئتها الأصلية.

لبدء هذا الإجراء ، بعد التضحية بالحيوان ، قم بإزالة الفك السفلي ، عن طريق إدخال زوج من المقصات الجراحية الكبيرة من خلال تجويف الفم ، وقطع عظام الفك السفلي والعضلات لكل جانب على حدة. بعد ذلك ، قم بإزالة جلد الفك العلوي وحول طرف الأنف باستخدام ملقط متوسط ، للوصول بشكل أفضل إلى القواطع. ثم استخدم مقص العظام لقطع الجزء الأكبر من القواطع بزاوية 45 درجة في الاتجاه المنقاري لتسهيل إزالة كبسولة VNO من تجويف الأنف.

لا تقطع جذر السن لمنع تلف طرف كبسولة VNO. بعد ذلك ، أمسك الحنك العلوي الصلب في الجزء المنقاري بملقط متوسط ، وقشره بعناية في قطعة واحدة بزاوية مسطحة. اشطف التجويف البحري بشكل متكرر بمحلول مثلج S2. ثم استخدم مقص زنبركي صغير لقطع الانصباب العظمي بين طرف عظم الفك والفك.

أدخل أطراف المقص بحيث يشير الجزء المنحني بعيدا عن VNO. وقطع العظم بعناية في خطوات صغيرة على كل من الجانب الأيسر والأيمن ، بشكل جانبي إلى كبسولة VNO. لإزالة كبسولة VNO ، قم بقطع عظم الفومر في الجزء الذيلي ، وارفع عظم الفومر بعناية من تجويف الأنف باستخدام ملقط متوسط.

انقل VNO على الفور إلى طبق بتري صغير تحت مجهر استريو على عبوة هلام الثلج ، حيث يجب تنفيذ الخطوات المتبقية من التشريح. بعد ذلك ، اشطف VNO بكمية صغيرة من الثلج S2 ، لمنع الأنسجة من الجفاف. بعد ذلك ، افصل الكبسولات الغضروفية التي تحتوي على الأنسجة الرخوة VNO عن طريق الإمساك بالجزء الخلفي من عظم الفومر بملقط متوسط.

لذلك ، ضع الكبسولة للحصول على عرض ظهري بحيث يصبح الانقسام بين كلا VNOs مرئيا. استخدم طرف الملقط الناعم لفصل كبسولات VNO الغضروفي عن العظم المركزي ، مع الحفاظ على عظم الفومر مثبتا في الجزء الخلفي. تأكد من إزالة جدار الغضروف الإنسي الذي تم توصيله مسبقا بعظم الفومر.

عند إزالة الغضروف حول VNO ، استخدم الملقط فقط عند حافة كبسولة الغضروف. واحرص على عدم إتلاف الظهارة الحسية الحساسة. لإزالة الغضروف المتبقي ، اقلب VNO بجانبه الجانبي المنحني إلى قاع الطبق وقم بتثبيت الغضروف بإحكام على جانب واحد باستخدام الملقط.

ثم حرك الملقط الدقيق الثاني بعناية من الجانب الخلفي بزاوية مسطحة جدا بين الغضروف و VNO لتخفيف الاتصال بين الأنسجة والغضاريف. لتجنب إتلاف الظهارة الحسية ، قشر VNO ببطء بعيدا عن الغضروف عن طريق تثبيته عند طرفه الذيلي. بمجرد رفع VNO من الكبسولة ، قم بإزالة جميع أجزاء الغضروف الصغيرة المتبقية لأن أي قطع متبقية من الغضروف ستفصل الأنسجة عن الاغاروز المحيط أثناء عملية التقطيع.

بعد ذلك ، ضع قطرة صغيرة من الثلج البارد S2 على أول VNO تم تشريحه لمنع تلف الأنسجة. لتضمين VNOs ، املأ كل من أطباق بتري الصغيرة على الحافة ب S3 المذاب. بعد ذلك ، اغمر كل VNO في الاغاروز وحركها أفقيا ذهابا وإيابا عدة مرات لإزالة فيلم المحلول خارج الخلية وكذلك أي فقاعات هواء من سطحه. ضع VNO عموديا ، بحيث يكون الطرف المنقاري مواجها لقاع الطبق.

بعد ذلك ، ضع كلا الطبقين على كيس ثلج هلامي ، وانتظر حتى يتجمد الاغاروز. لا تغير اتجاه VNO بمجرد أن يبدأ الاغاروز في التصلب ، لأن هذا سيفصل الأنسجة عن الاغاروز المحيط. في هذا الإجراء ، استخدم ملعقة صغيرة لإزالة كتلة الاغاروز من الطبق الصغير إلى غطاء طبق بتري كبير ، واقلب الاغاروز رأسا على عقب ، تاركا الطرف المنقاري ل VNO متجها لأعلى.

بعد ذلك ، قم بقص الكتلة إلى شكل هرمي باستخدام مشرط جراحي ، واحرص على عدم إتلاف الأنسجة المضمنة. بعد ذلك ، استخدم الغراء الفائق لتثبيت الكتلة على شكل هرم في وسط لوحة عينة الاهتزاز. وانتظر حوالي دقيقة واحدة حتى يجف الغراء تماما.

قم بتقطيع العينة إلى أقسام بسمك 150 إلى 200 ميكرومتر. افحص لفترة وجيزة مورفولوجيا الشريحة تحت مجهر التشريح. ثم انقل جميع الشرائح إلى غرفة الأكسجين حتى الاستخدام.

في هذه الخطوة ، انقل شريحة VNO إلى غرفة التصوير وقم بإصلاح موضع الشريحة باستخدام مرساة من الفولاذ المقاوم للصدأ سلكية بألياف تركيبية بسمك نقطة واحدة ميلومتر. لا تغطي شريحة المناديل بأي من خيوط الألياف الاصطناعية. بعد ذلك ، انقل غرفة التصوير إلى إعداد التسجيل وقم بدمج الشريحة باستمرار مع S2 المؤكسج في درجة حرارة الغرفة.

اضبط الشعيرات الدموية للشفط على سطح المحلول لإنشاء تبادل مستمر لمحلول الحمام. ثم اضبط قلم الرصاص الثمانية في واحد متعدد الأسطوانات أعلى وبالقرب من الجزء غير الحسي من شريحة VNO التي تحتوي على الأوعية الدموية. بعد ذلك ، قم بتوصيل القطب المرجعي ومحلول الحمام باستخدام جسر أجار على شكل حرف L مملوء بكلوريد البوتاسيوم 150 ملليمول.

بعد ذلك، املأ ماصة التصحيح بمحلول الماصة S4. قم بتركيب الماصة فوق القطب الكهربائي المطلي بكلوريد الفضة المتصل بمرحلة الرأس دون كشط الطلاء وقم بتثبيته بإحكام. ثم قم بالضغط الإيجابي الطفيف على ماصة التصحيح قبل دخول الحمام. راقب الماصة وتأكد من أنها تتراوح بين أربعة ميغا أوم و 10 ميغا أوم.

تصور شريحة VNO باستخدام كاميرا CCD باستخدام DIC المحسن بالأشعة تحت الحمراء ، وحدد FPR-rs3 i-Venus التي تعبر عن الخلايا أو الخلايا العصبية المصنفة بالمثل باستخدام إضاءة الإزهار ومكعب مرشح مناسب. اقترب من جسم الخلية باستخدام عجلات يدوية للحصول على أقصى قدر من الحساسية. بسبب الضغط الإيجابي ، يصبح انبعاج صغير على غشاء سوما الخلية مرئيا بمجرد أن يكون طرف الماصة قريبا.

ثم حرر الضغط الإيجابي وقم بتطبيق ضغط سلبي طفيف لامتصاص غشاء الخلية من أجل الحصول على ختم مقاومة عالية من واحد إلى 20 جيجا أوم. بعد ذلك ، قم بتطبيق شفط قصير ولطيف لتعطيل غشاء الخلية وإنشاء تكوين الخلية بالكامل. في هذا الشكل ، تظهر الصورة متحدة البؤر لشريحة أنسجة VNO الإكليلية توزيع الخلايا العصبية الإيجابية الفلورية FPR-rs3 Tau Venus في الظهارة الحسية الصوتية.

تظهر الخلايا العصبية الإيجابية FPR-rs3 Tau Venus تغصنارا قميا واحدا ينتهي بهيكل يشبه المقبض عند الحدود اللمعة. وتظهر هنا تسجيلات مشبك تصحيح الخلية بأكملها التي يتم إجراؤها من VSN soma. فيما يلي الآثار التمثيلية من تسجيلات مشبك التصحيح بالجملة لتيار الصوديوم سريع التنشيط الحساس ل TTX ، و FPR-rs3 VSNs الإيجابية.

تكشف تسجيلات خطوة الجهد في ظل ظروف التحكم عن تيار داخلي سريع وعابر يعتمد على الجهد. علاج TTX عند ميكرومولار واحد يقلل بشدة من التيار. ويكشف التتبع المطروح رقميا الموضح هنا عن تيار الصوديوم المسور بالجهد الحساس TTX.

تظهر آثار المشبك الحالية التمثيلية إزالة الاستقطاب والاستقطاب المفرط وقطارات إمكانات العمل المتولدة عند حقن التيار الإيجابي والسلبي خطوة بالموضوع. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء عملية التشريح وتقطيع الأنسجة بأكملها في غضون ساعة واحدة تقريبا لكل من VNOs. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تسجيلات التصحيح السائبة خارج الخلية أو تصوير الكالسيوم من أجل زيادة الإنتاجية عند تحليل مجموعات أكبر من الخلايا العصبية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عمل شرائح الأنسجة الحادة من العضو الصوتي الفم ، وكيفية إجراء تسجيلات فسيولوجية كهربائية أحادية الخلية من الخلايا العصبية الحسية الصوتية.