Name: لإعداد المائل الحبل الشوكي شرائح لبطني الجذر تحفيز (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: تعلم طريقة تحضير شرائح مائلة من الحبل الشوكي في الفئران الصغيرة لتحفيز الجذور البطنية. تتيح هذه التقنية تحديد الخلايا الحركية ودراسة الخلايا البطنية التي تتغذى منها.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

الكتاب أشكر مارين مانويل وأوليفيا غولدمان Szwajkajzer لمساعدتهم في اتخاذ الصور. أشكر الكتاب أيضا أرجون Masukar وتوبياس بوك لتنقيح الكتابة المخطوطة. وقدمت الدعم المالي من قبل الوكالة الوطنية من أجل لا بحوث (HYPER-الفرقة المتعددة الجنسيات، وكالة الاستخبارات الوطنية-2010-بلان-1429-1401)، والمعاهد الوطنية للصحة NINDS (R01NS077863)، ومؤسسة لاتران تييري (مشروع OHEX)، والجمعية الفرنسية لاعتلال عضلي ( منحة رقم 16026)، والهدف ALS وامتنان. وكان فيليكس ليروي المستفيد من &quot;Contrat الدكتوراه&quot; من مدرسة المعلمين العليا، كاشان.

وقد أجريت التجارب وفقا للتوجيهات الأوروبية (86/609 / أوروبا الوسطى والشرقية و2010-63-UE) والتشريع الفرنسي، وتمت الموافقة من قبل لجنة الأخلاق جامعة باريس ديكارت. 1. الحبل الشوكي إعداد شريحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحلول التالية يوميا أو يوم واحد مقدما. إذا كان يحتفظ بها بين عشية وضحاها، فقاعة مع 95٪ O 2 و 5٪ CO 2 و يحفظ في الثلاجة في زجاجة مغلقة بإحكام. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد منخفضة الصوديوم السائل الاصطناعي النخاعي (ACSF): 3 ملي بوكل، 1 ملم ناه 2 ص 4، 230 ملي السكروز، 26 مم NaHCO 3، 0.8 ملي CaCl 2، 8 ملي MgCl 2 و 25 ملي الجلوكوز، 0.4 ملي حمض الاسكوربيك، 1 ملم نا kynurenate، 2 مم نا البيروفات. فقاعة مع 95٪ O 2 و 5٪ CO 2 (7.4 درجة الحموضة). منذ نا kynurenate غالبا ما يكون من الصعب حل، تأكد من شراء واحدة المدرجة في جدول المواد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير المحاليل K-جلوكوناتنشوئها: 130 ملي K-غلوكونات، 15 ملي بوكل، 0.05 ملي EGTA، 20 ملي HEPES 25 ملي الجلوكوز، 1 ملم نا kynurenate، 2 مم نا البيروفات، بعد تعديلها لدرجة الحموضة 7.4 مع KOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ACSF: 130 مم كلوريد الصوديوم، 2.5 ملي بوكل، 2 مم CaCl 2، 1 ملم MgCl 2، 1 ملم ناه 2 ص 4، 26 ملم NaHCO 3 و 25 ملي الجلوكوز، 0.4 ملي حمض الاسكوربيك، 2 مم نا البيروفات. فقاعة مع 95٪ O 2 و 5٪ CO 2 (7.4 درجة الحموضة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل بداية التشريح، حل 2٪ أجار في 80 مل من محلول K-غلوكونات، والدفء عند 60 درجة مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> داخل القلب نضح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء هذا المستحضر على الفئران الذكور والإناث، تتراوح أعمارهم بين P2 إلى P11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفأر مع حقنة داخل الصفاق من 0.1 مل من 25 ملي الصوديوم بنتوباربيتال (50 ملغ / كلغ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الإبر أو شريط، لشل حركة الماوس على ظهرها على طبق بتري كبيرة مملوءة السيليكون. استخدام مجهر تشريحه لبقية تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد غيض من القص، ورفع الصدر وقطع الحجاب الحاجز باستخدام مقص غرامة. ثم فتح الصدر على كلا الجانبين من خلال قطع أضلاعه لفضح القلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الأذين الأيمن قبل ثقب البطين الأيسر مع إبرة 27G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يروي مع انخفاض الصوديوم + ACSF الجليد الباردة. بعد 30 ثانية، وينبغي أن ينظر المنخفض الصوديوم + ACSF المتدفقة من الأذين. كميات قليلة من الصوديوم تمنع الخلايا من ارتفاعه وتقلل من الموت الخلوي أثناء تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على عقد إبرة في قلب تحت المجهر تشريح حتى يتحول الكبد الصفراء عندما يتم استنزاف الدم. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح الحبل الشوكي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع رأس الحيوان ووضعه على بطنه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بسرعة إزالة الجلد من الخلف (الشكل 1A1). جعل اثنين من التخفيضات من خلال الكتفين ونزول القفص الصدر (الشكل 1A2). ثم قطع الحبل كما لآه ممكن في قسم الذيلية من أجل عزل العمود الفقري مع بداية الأضلاع من الجزء السفلي من الحيوان. الوجه الحيوان مرة أخرى وإزالة الأحشاء لا تزال تعلق على الأضلاع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل العمود الفقري لآخر، أصغر المليئة السيليكون طبق بتري واستخدام 4 دبابيس الحشرات لأنه عقد ظهري حتى الجانب (الشكل 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستمرار يروي الحيوان مع ACSF-فقاعات كربوجين (في حوالي 4 درجات مئوية) أثناء إجراء الثقب من الجانب الظهري، وفضح الحبل الشوكي من نهاية منقاري (الشكل 1B). للقيام بذلك، إدراج غيض من مقص غرامة بين العظم والنخاع الشوكي وقطع العظام شيئا فشيئا من نهاية منقاري، والتأكد من أن يبقى بعيدا عن المادة البيضاء. تتناوب على كل جانب في حين أن استخدام ملاقط لالابتعاد الفرقة العظام خفضت بالفعل (الشكل 1B1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام أصغر مقص الربيع المتاحة وملاقط، ورفع الجافية وقطععلى كلا الجانبين في حين عقد الجزء فضفاض من الجافية من أجل تجنب إتلاف الحبل الشوكي مع مقص. قطع على طول محور rostro الذيلية. ملاحظة: الجافية هو غشاء شفاف المستمر نصف. في هذا العصر الأم الحنون هشة للغاية وسوف تأتي بعيدا أثناء تشريح وتقطيع (الشكل 1B2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة الجافية هو استخدام إزالة الزجاج حادة أو طرف من البلاستيك لدفع برفق الحبل على الجانب الأيسر من الأخدود التي شكلتها العمود الفقري نصف قطع، وقطع الجذور البطنية والظهرية على الجانب الأيمن، بدءا من الجانب منقاري ، الأبعد من حيث تدخل النخاع (عدد قليل من مم على الأقل، الشكل 1B2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر العملية على الجانب الأيسر، والذهاب دائما من منقاري إلى الذيلية. إذا أعسر، بدء من الجانب الأيسر ومن ثم الانتقال إلى الجانب الأيمن. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضمين في أجار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زلة الحبل من العمود الفقري. استخدام دبوس الحشرات أصغر ليتعرفواالحبل مع الظهرية سطح صعودا وبدقة إزالة أي جزء من الغشاء لا تزال تعلق عليه (الشكل 1C1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيفها مرة واحدة، وتقليم طرفي (الشكل 1C2). إدراج دبوس الحشرات محني في الجزء الأمامي من الحبل لمعالجة الحبل وملاحظة توجهها (السهم في الشكل 1C2). ثم نقل النخاع الشوكي إلى حل K-جلوكونات الجليد الباردة. ملاحظة: هذا الحل يقلد تكوين الخلايا من السائل النخاعي، وسوف يمنع الخلايا من الموت من صدمة التناضحي مرة واحدة سيتم قطع العصبونات الحركية 26. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة في الحبل الشوكي ضمن الحل داخل الخلايا، واتخاذ الكأس مع آغار من الحمام الجاف وتبريده على مزيج من الثلج والماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على اثارة بينما قياس درجة الحرارة. عندما تصل درجة الحرارة إلى 38 درجة مئوية تزج الحبل الشوكي، وعقد من قبل دبوس الحشرات ووضعه الجانب منقاري أسفل. تأكد من أن الحبل الشوكي كما هو الواحدraight ممكن، بعيدا عن الجدران، جزء الذيلية قليلا نحو الأعلى (الشكل 1D1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك الدورق في خليط من الثلج والماء للسماح للأجار ليصلب في أسرع وقت ممكن. تأكد من أنه يبقى في مكان وأن الحبل هو كما مستقيم ممكن (الشكل 1D1). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التصلب، وخفض كتلة آغار تحتوي على النخاع الشوكي في مثل هذه الطريقة التي قاعدة كتلة هي في زاوية 35 درجة مع الجزء القطنية من الحبل (السهم في الشكل 1D2). السطح الظهري يجب أن تواجه بعيدا عن قاعدة (الشكل 1D2). ملاحظة: هذا هو خطوة حاسمة في هذا الإجراء، للحفاظ على استمرارية حمامات العصبون الحركي للجذور بطني من الذي الخروج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الغراء كتلة في غرفة من vibratome باستخدام cyanoacrylate الغراء. تزج به في حل K-جلوكونات وإضافة slushed المجمدة حل K-جلوكونات للحفاظ علىحمام برود (أقل من 2 درجة مئوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع 350-400 ميكرون شرائح سميكة من منطقة أسفل الظهر (التعرف عليها عن طريق انحناء وقطر أكبر). في التوجه السليم (انظر 1.4.1.)، استخدم شفرة لقطع من ظهري إلى السطح البطني وجعل شرائح أكثر باستمرار منقاري. عادة، هناك 4-5 شرائح مناسبة مع الجذور البطنية تمتد 2 مم أو أكثر. استخدام المعلمات التالية: 10 درجة زاوية، 70 هرتز تردد الاهتزاز و 10 مم / سرعة دقيقة من تشريح. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حضانة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل شرائح لACSF في 34 درجة مئوية. بعد ما يقرب من 30 دقيقة، تبريد شرائح وصولا الى RT والبدء في تسجيل الدورة. </li></ol></li></ol><img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54525/54525fig1.jpg" /> الشكل 1. تشريح A1: إزالة الجلد من الجزء الخلفي لفضح العمود الظهري A2:قطع الكتفين والضلوع لتحرير ظهري العمود B1: العمود الفقري معقود على طبق بتري مليئة السيليكون (الجانب الظهري، والجانب الذيلية اليسار) B2: الشيء نفسه مع الحبل الشوكي المكشوفة وتشريح C1: الحبل الشوكي معزولة (الجانب منقاري إلى اليسار) C2: الحبل الشوكي على استعداد لتكون جزءا لا يتجزأ (الجانب البطني، والجانب منقاري إلى اليسار). لاحظ دبوس الحشرات أصغر على الجانب منقاري D1:. الحبل الشوكي في الدورق أجار (الجانب منقاري داو، الجانب البطني مواجهة القاع) D2: قص كتلة أجار مع الحبل الشوكي المضمنة. لاحظ زاوية 35 درجة الأشكال الحبل الشوكي مع قاعدة كتلة وتوسيع قطني (السهم). أشرطة النطاق 1 سم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54525/54525fig1large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> 2. وضع شريحة في الغرفة ملاحظة: هاءجذور ntral ذات حجم متغير. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد مربع من مختلف الماصات بأقطار تتراوح طرف 40-170 ميكرون مقدما. لإعداد الماصات الشفط، وإعداد العديد من الماصات مع تفتق طويل. باستخدام سكين الماس، اجراء خفض في المواقف المختلفة. ثم تشريح تحت المجهر، وكسر ذلك عن طريق ضرب طرف مع ملاقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة غرفة من المجهر تسجيل ووضعه تحت المجهر تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار شريحة تحتوي على جذر بطني من مدة كافية (2 ملم أو أكثر) لتركيبها على القطب التحفيز الشفط. حدد الاتجاه الصحيح للشريحة مع الجذور البطنية التصاعدي (الشكل 2A) وقطع بدقة آغار حول الجذور البطنية بينما ترك بقية آغار حول شريحة (الشكل 2B). ملاحظة: نظرا لأن أجار هو أقوى من شريحة، وهذا سوف يسمح للخيوط مرساة شريحة للراحة على أجار بدلا من التركيز على شريحة وبالتالي لسوف nchor لا تضر الأنسجة. تأكد من خيوط مرساة شريحة هي فوق بركة العصبون الحركي (كما هو موضح باللون الأحمر في الشكل 2C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل الغرفة مرة أخرى على المجهر ويروي باستمرار غرفة تسجيل مع ACSF بمعدل 1-2 مل / دقيقة، في RT. باستخدام ماصة زجاجية مملوءة ACSF وتوصيلها إلى حقنة، تمتص واحد من جذر بطني (السهم في الشكل 2C). من أجل تحقيق التحفيز الجيد من جذر بطني، وغيض ماصة يجب أن يكون ضيق حول الجذر البطني. وينبغي أن تكون واحدة القطب في القطب محفزة وغيرها من واحد في الحمام (أو متصلا إشارة القطب-لقط التصحيح). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقيق تسجيل التصحيح، المشبك من المطلوب من نوع الخلية وتسجيل تأثير التحفيز جذر بطني كما هو موضح previsouly 10. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هنا، استخدام مكبر للصوت للحصول على البيانات. تصفية تسجيلات خلية كاملة في 3 كيلو هرتز. رقمنة في 10 كيلوهرتز. تعويض مقاومة جسر في كوريهوضع الإقليم الشمالي المشبك. </li></ol></li></ol><img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54525/54525fig2.jpg" /> الشكل 2. إعداد جذر بطني ج: قطني شريحة الحبل الشوكي جزءا لا يتجزأ من أجار مع الجذر البطني مواجها لها ب: قطني شريحة الحبل الشوكي مع الجذور البطنية تحررت من أجار C: قطني شريحة الحبل الشوكي مع القطب محفزة وضعت بإحكام حول جذور بطني (السهم) . لاحظ مكان الخلايا رينشو التعبير عن مضان أحمر في 28 chrna2-لجنة المساواة العرقية الماوس عبرت مع مراسل الماوس R26 توم 17. القضبان مقياس 1 مم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54525/54525fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<ol><li>Brooks, C. M., Downman, C. B., Eccles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((After-potentials+and+excitability+of+spinal+motoneurones+following+antidromic+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">After-potentials and excitability of spinal motoneurones following antidromic activation.</a> J Neurophysiol. 13 (1), 9-38 (1950).</li>
<li>Bories, C., Amendola, J., Lamotte d'Incamps, B., Durand, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+electrophysiological+abnormalities+in+lumbar+motoneurons+in+a+transgenic+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Early electrophysiological abnormalities in lumbar motoneurons in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Eur J Neurosci. 25 (2), 451-459 (2007).</li>
<li>Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+currents+in+visually+identified+motoneurones+of+neonatal+rat+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Membrane currents in visually identified motoneurones of neonatal rat spinal cord.</a> J Physiol. 423, 27-46 (1990).</li>
<li>Hori, N., Tan, Y., Strominger, N. L., Carpenter, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+activity+of+rat+spinal+cord+motoneurons+in+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Intracellular activity of rat spinal cord motoneurons in slices.</a> J Neurosci Methods. 112 (2), 185-191 (2001).</li>
<li>Arai, Y., Mentis, G. Z., Wu, J. Y., O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventrolateral+origin+of+each+cycle+of+rhythmic+activity+generated+by+the+spinal+cord+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Ventrolateral origin of each cycle of rhythmic activity generated by the spinal cord of the chick embryo.</a> PLoS One. 2 (5), e417(2007).</li>
<li>Cullheim, S., Lipsenthal, L., Burke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+monosynaptic+contacts+between+type-identified+alpha-motoneurons+in+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Direct monosynaptic contacts between type-identified alpha-motoneurons in the cat.</a> Brain Res. 308 (1), 196-199 (1984).</li>
<li>Cullheim, S., Kellerth, J. O., Conradi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+direct+synaptic+interconnections+between+cat+spinal+alpha-motoneurons+via+the+recurrent+axon+collaterals%3A+a+morphological+study+using+intracellular+injection+of+horseradish+peroxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Evidence for direct synaptic interconnections between cat spinal alpha-motoneurons via the recurrent axon collaterals: a morphological study using intracellular injection of horseradish peroxidase.</a> Brain Res. 132 (1), 1-10 (1977).</li>
<li>Gogan, P., Gueritaud, J. P., Horcholle-Bossavit, G., Tyc-Dumont, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+excitatory+interactions+between+spinal+motoneurones+of+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Direct excitatory interactions between spinal motoneurones of the cat.</a> J Physiol. 272 (3), 755-767 (1977).</li>
<li>Ichinose, T., Miyata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+excitation+of+motoneurons+in+the+isolated+spinal+cord+of+newborn+rats+detected+by+whole-cell+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Recurrent excitation of motoneurons in the isolated spinal cord of newborn rats detected by whole-cell recording.</a> Neurosci Res. 31 (3), 179-187 (1998).</li>
<li>Lamotte d'Incamps, B., Ascher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+excitatory+postsynaptic+ionotropic+receptors+coactivated+at+the+motoneuron-Renshaw+cell+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Four excitatory postsynaptic ionotropic receptors coactivated at the motoneuron-Renshaw cell synapse.</a> J Neurosci. 28 (52), 14121-14131 (2008).</li>
<li>Renshaw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+effects+of+centripetal+impulses+in+axons+of+spinal+ventral+roots%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Central effects of centripetal impulses in axons of spinal ventral roots.</a> J Neurophysiol. 9, 191-204 (1946).</li>
<li>Renshaw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+nerve+impulses+in+the+gray+matter+as+a+mechanism+in+central+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Fed+Proc%22%5BJournal%5D)">Interaction of nerve impulses in the gray matter as a mechanism in central inhibition.</a> Fed Proc. 5 (1 Pt 2), 86(1946).</li>
<li>Renshaw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+interaction+of+nerve+impulses+in+the+gray+matter+and+on+the+nature+of+central+inhibition%29%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Observations on interaction of nerve impulses in the gray matter and on the nature of central inhibition).</a> Am J Physiol. 146, 443-448 (1946).</li>
<li>Pambo-Pambo, A., Durand, J., Gueritaud, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+excitability+changes+in+lumbar+motoneurons+of+transgenic+SOD1G85R+and+SOD1G%2893A-Low%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Early excitability changes in lumbar motoneurons of transgenic SOD1G85R and SOD1G(93A-Low) mice.</a> J Neurophysiol. 102 (6), 3627-3642 (2009).</li>
<li>Quinlan, K. A., Schuster, J. E., Fu, R., Siddique, T., Heckman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+postnatal+maturation+of+electrical+properties+in+spinal+motoneurons+in+a+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Altered postnatal maturation of electrical properties in spinal motoneurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Physiol. 589 (Pt 9), 2245-2260 (2011).</li>
<li>Martin, E., Cazenave, W., Cattaert, D., Branchereau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+alteration+of+motoneuronal+morphology+induces+hyperexcitability+in+the+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Embryonic alteration of motoneuronal morphology induces hyperexcitability in the mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Neurobiol Dis. 54, 116-126 (2013).</li>
<li>Hadzipasic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+degeneration+of+a+physiological+subtype+of+spinal+motor+neuron+in+mice+with+SOD1-linked+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Selective degeneration of a physiological subtype of spinal motor neuron in mice with SOD1-linked ALS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16883-16888 (2014).</li>
<li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110 (3), 385-397 (2002).</li>
<li>Tallini, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAC+transgenic+mice+express+enhanced+green+fluorescent+protein+in+central+and+peripheral+cholinergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons.</a> Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).</li>
<li>Manuel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+kinetics%2C+high-frequency+oscillations%2C+and+subprimary+firing+range+in+adult+mouse+spinal+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons.</a> J Neurosci. 29 (36), 11246-11256 (2009).</li>
<li>Obeidat, A. Z., Nardelli, P., Powers, R. K., Cope, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+motoneuron+firing+by+recurrent+inhibition+in+the+adult+rat+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Modulation of motoneuron firing by recurrent inhibition in the adult rat in vivo.</a> J Neurophysiol. 112 (9), 2302-2315 (2014).</li>
<li>Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+intrinsic+hyperexcitability+does+not+contribute+to+motoneuron+degeneration+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Elife. 3, (2014).</li>
<li>Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+currents+dynamically+set+the+recruitment+and+firing+properties+of+F-type+motoneurons+in+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Potassium currents dynamically set the recruitment and firing properties of F-type motoneurons in neonatal mice.</a> J Neurophysiol. 114 (3), 1963-1973 (2015).</li>
<li>Lamotte d'Incamps, B., Ascher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+composition+and+kinetics+of+the+Renshaw+cell+heteromeric+nicotinic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Subunit composition and kinetics of the Renshaw cell heteromeric nicotinic receptors.</a> Biochem Pharmacol. 86 (8), 1114-1121 (2013).</li>
<li>Lamotte d'Incamps, B., Krejci, E., Ascher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+shaping+the+slow+nicotinic+synaptic+current+at+the+motoneuron-renshaw+cell+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms shaping the slow nicotinic synaptic current at the motoneuron-renshaw cell synapse.</a> J Neurosci. 32 (24), 8413-8423 (2012).</li>
<li>Dugue, G. P., Dumoulin, A., Triller, A., Dieudonne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target-dependent+use+of+co-released+inhibitory+transmitters+at+central+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Target-dependent use of co-released inhibitory transmitters at central synapses.</a> J Neurosci. 25 (28), 6490-6498 (2005).</li>
<li>Mentis, G. Z., Siembab, V. C., Zerda, R., O'Donovan, M. J., Alvarez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+afferent+synapses+on+developing+and+adult+Renshaw+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Primary afferent synapses on developing and adult Renshaw cells.</a> J Neurosci. 26 (51), 13297-13310 (2006).</li>
<li>Perry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firing+properties+of+Renshaw+cells+defined+by+Chrna2+are+modulated+by+hyperpolarizing+and+small+conductance+ion+currents+Ih+and+ISK%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Firing properties of Renshaw cells defined by Chrna2 are modulated by hyperpolarizing and small conductance ion currents Ih and ISK.</a> Eur J Neurosci. 41 (7), 889-900 (2015).</li>
<li>Thurbon, D., Luscher, H. R., Hofstetter, T., Redman, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+electrical+properties+of+ventral+horn+neurons+in+rat+spinal+cord+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Passive electrical properties of ventral horn neurons in rat spinal cord slices.</a> J Neurophysiol. 79 (5), 2485-2502 (1998).</li>
<li>Zengel, J. E., Reid, S. A., Sypert, G. W., Munson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+electrical+properties+and+prediction+of+motor-unit+type+of+medial+gastrocnemius+motoneurons+in+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Membrane electrical properties and prediction of motor-unit type of medial gastrocnemius motoneurons in the cat.</a> J Neurophysiol. 53 (5), 1323-1344 (1985).</li>
<li>Cooper, S., Sherington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gower%27s+tract+and+spinal+border+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Gower's tract and spinal border cells.</a> Brain. 63, 123-124 (1940).</li>
<li>Morin, F., Schwartz, H. G., O'Leary, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+study+of+the+spinothalamic+and+related+tracts%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Psychiatr+Neurol+Scand%22%5BJournal%5D)">Experimental study of the spinothalamic and related tracts.</a> Acta Psychiatr Neurol Scand. 26 (3-4), 371-396 (1951).</li>
<li>Sengul, G., Fu, Y., Yu, Y., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+projections+to+the+cerebellum+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Spinal cord projections to the cerebellum in the mouse.</a> Brain Struct Funct. 220 (5), 2997-3009 (2015).</li>
<li>Russier, M., Carlier, E., Ankri, N., Fronzaroli, L., Debanne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A-%2C+T-%2C+and+H-type+currents+shape+intrinsic+firing+of+developing+rat+abducens+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">A-, T-, and H-type currents shape intrinsic firing of developing rat abducens motoneurons.</a> J Physiol. 549 (Pt 1), 21-36 (2003).</li>
<li>Dourado, M., Sargent, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+nicotinic+receptors+underlying+Renshaw+cell+excitation+by+alpha-motor+neurons+in+neonatal+rat+spinal+cord%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Properties of nicotinic receptors underlying Renshaw cell excitation by alpha-motor neurons in neonatal rat spinal cord).</a> J Neurophysiol. 87 (6), 3117-3125 (2002).</li>
<li>Mitra, P., Brownstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+spinal+cord+slice+preparation+for+recording+from+lumbar+motoneurons+of+the+adult+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse.</a> J Neurophysiol. 107 (2), 728-741 (2012).</li>
<li>Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurotoxicity+of+excitatory+amino+acids+is+produced+by+passive+chloride+influx%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx.</a> J Neurosci. 5 (6), 1483-1489 (1985).</li>
<li>Olney, J. W., Price, M. T., Samson, L., Labruyere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+specific+ions+in+glutamate+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">The role of specific ions in glutamate neurotoxicity.</a> Neurosci Lett. 65 (1), 65-71 (1986).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

تشريح منحرف من الحبل الشوكي هو مهم لأنه يسمح لتحفيز جانب واحد من حمامات العصبون الحركي والخلايا رينشو في الجزء الفقري واحد بطريقة موثوقة وشاملة ومحددة. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح لتحديد سريع، أنيق وغير ملتبس من العصبونات الحركية المسجلة. المقبل، ونحن سوف تسلط الضوء على مزايا هذه التقنية مقارنة مع أساليب إعداد شريحة أخرى، وبعد ذلك سوف نؤكد من المزالق الأكثر شيوعا لتجنب حين تنفيذ هذا الإجراء. معظم الدراسات التي تستخ...

تاريخيا، أجريت التسجيلات العصبون الحركي باستخدام حاد الكهربائي في الجسم الحي على الحيوانات الكبيرة مثل القطط والفئران 1 أو على الحبل الشوكي كله معزولة في الفئران 2. ودعا الوصول المباشر إلى العصبون الحركي ظهور تقنية تسجيل التصحيح، المشبك خلال 1980s، somas كما الختم اللازمة لتحقيقها تحت التوجيه البصري. وهكذا، تم تحقيق الشوكي إعداد الحبل شريحة بسهولة منذ أوائل 1990s 3. ومع ذلك، إعداد شريحة في وقت مبكر في كثير من الأحيان لا تسمح لتحفيز الجذور البطنية. إلى علمنا، وذكرت اثنين فقط من الدراسات التحفيز الناجح لجذور بطني في شرائح عرضية، وتم الحصول على أي من الفئران 4،5. في هذه المقالة نقدم تقنية لتحقيق شرائح الحبل الشوكي قابلة للحياة الفئران حديثي الولادة (P2 - P11) الذي تجمع العصبون الحركي يحتفظ الجذر المغادرين المحاور في بطني. منفسالتحفيز الجذرية راؤول يطلق إمكانات العمل معاكسة للمسيرة العودة الى somas تجمع العصبون الحركي تخرج من نفس الجذر البطني. لأنه يثير أيضا الأهداف ضمانات العصبون الحركي، العصبونات الحركية الأخرى 6-10 والخلايا رينشو 11-13. منذ العصبونات الحركية فقط ترسل المحاور إلى أسفل جذور بطني، ونحن نستخدم تسجيل إمكانات العمل معاكسة للمسيرة باعتبارها وسيلة بسيطة ونهائية لphysiologicaly تحديد العصبونات الحركية 10. بالإضافة إلى استخدام معيارا الكهربية والمورفولوجية يحتمل أن تكون غير شاملة أو مضللة لتأكيد هوية العصبون الحركي، اعتمدت الدراسات التي أجريت مؤخرا على العصبونات الحركية في النخاع الشوكي أيضا على مملة ومضيعة للوقت اللاحق stainings 16. عادة ما يتم إجراء هذا التحديد فقط على عينة من الخلايا المسجلة. تعتمد استراتيجيات هوية أخرى على خطوط الماوس فيه العصبونات الحركية تعبر عن مضان الذاتية <sup&gt; 17-19. ومع ذلك، باستخدام علامات المشفرة وراثيا قد يكون من الصعب في سن مبكرة عندما التعبير علامة لا يزال متغير أو إذا اقتضت الدراسة بالفعل باستخدام خط الماوس المعدلة وراثيا. بدلا من ذلك، عمل معاكس للمسيرة التسجيلات المحتملة يمكن أن يؤديها بشكل روتيني على جميع الفئران من بداية تسجيل الخلية. المجربون العمل على الاستعدادات الحبل الشوكي سليمة في القط، الجرذان والفئران، وقد استخدمت هذه التقنيات بشكل موثوق هوية منذ عام 1950 1،2،20،21. في الظروف المثلى، تمكنا من انتزاع امكانات العمل معاكسة للمسيرة من تقريبا كل من العصبونات الحركية المسجلة. وعلاوة على ذلك، وتحفيز جذر بطني يمكن استخدامها لإثارة موثوق العصبونات الحركية الأخرى 22،23 أو أهدافها. الخلايا رينشو 10،24،25. نقدم هنا تطبيقات التحفيز الجذر البطني في شكل عمل معاكس للمسيرة التسجيلات المحتملة من somas العصبون الحركي، فضلا عن إثارة الخلايا رينشو.

<table><tbody><tr><td>Na-kynurenate</td><td>ABCAM</td><td>ab120256</td><td>يذوب بشكل أفضل من العلامات التجارية الأخرى</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>sukrose&nbsp;</td><td>سيجما</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3&nbsp;</td><td>سيجما</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&nbsp;</td><td>G Biosciences</td><td>R040</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp;</td><td>جودة البيولوجية</td><td>351-033-721</td><td></td></tr><tr><td>الجلوكوز&nbsp;</td><td>سيجما</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>حمض الأسكوربيك &nbsp;</td><td>سيجما</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>Na-pyruvate&nbsp;</td><td>سيجما</td><td>P2250</td><td></td></tr><tr><td>K-gluconate &nbsp ؛</td><td>سيجما</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>EGTA&nbsp;</td><td>سيجما</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>سيجما</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الصوديوم</td><td>سيجما</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>أجار</td><td>سيجما</td><td>A9799</td><td></td></tr><tr><td>QX-314</td><td>ألومون</td><td>Q150</td><td></td></tr><tr><td>ملغ-ATP</td><td>سيجما</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>CsOH</td><td>سيجما</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>Na-GTP</td><td>سيجما</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>حمض الجلوكونيك</td><td>سيجما</td><td>G1951</td><td></td></tr><tr><td>محلول هيدروكسيد السيزيوم</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors - 2.5 مم &nbsp ؛</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td>يستخدم فقط لقطع الجافية ، قد يتلف في حالة قطع العظام</td></tr><tr><td>محفز</td><td></td><td>النبض المعزول لأنظمة AM موديل 2100</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Campden</td><td>يهتز Microtome 7000 - موديل 7000smz-2</td><td></td></tr></tbody></table>

لإعداد المائل الحبل الشوكي شرائح لبطني الجذر تحفيز

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

وقد أثبتت التسجيلات الكهربية من شرائح الحبل الشوكي لتكون تقنية قيمة للتحقيق في مجموعة واسعة من الأسئلة، من الخلوية إلى خصائص الشبكة. وتبين لنا كيفية تحضير شرائح مائلة قابلة للحياة من الحبل الشوكي من الفئران الشابة (P2 - P11). في هذا الإعداد، والعصبونات الحركية تحتفظ المحاور التي تخرج من الجذور البطنية من النخاع الشوكي. تحفيز هذه المحاور يثير-نشر يعود إمكانات العمل غزو somas العصبون الحركي ومثيرة الضمانات والعصبون الحركي داخل الحبل الشوكي. تسجيل امكانات العمل معاكسة للمسيرة هو وسيلة فورية، نهائية وأنيقة لتوصيف هوية العصبون الحركي، والذي يتجاوز أساليب هوية أخرى. وعلاوة على ذلك، وحفز الضمانات العصبون الحركي هو وسيلة بسيطة وموثوق بها لإثارة أهداف ضمانات من العصبونات الحركية في النخاع الشوكي، مثل العصبونات الحركية أو R أخرىenshaw الخلايا. في هذا البروتوكول، ونحن تقديم التسجيلات معاكسة للمسيرة من العصبون الحركي somas وكذلك رينشو إثارة الخلية، الناجم عن التحفيز الجذر البطني.

تأكيد العصبون الحركي الهوية باستخدام إمكانيات معاكس للمسيرة العمل استهداف الخلايا تم العثور على العصبونات الحركية في القرن البطني (مرئية باللون الأحمر في الشكل 2C). ابدأ من حزمة من المحاور التي تشكل ...

وتبين لنا كيفية تحضير شرائح مائلة من الحبل الشوكي في الفئران الشابة. هذا الإعداد يسمح لتحفيز الجذور البطنية.

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير شرائح مائلة من النخاع الشوكي تسمح بتحفيز الجذور البطنية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تسمح بتحديد العصبونات الحركية من خلال تحفيز الجذر البطني ودراسة الخلايا البطنية التي تغذيها التفرعات المحورية للعصبونات الحركية. لقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عند الحاجة إلى وسيلة موثوقة لتحفيز الخلايا البطنية.سيواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة بسبب تعقيد التنفيذ السليم للخطوات المختلفة لعملية التشريح. ابدأ بإجراء تروية لفأر في المرحلة العمرية من P2 إلى P11 باستخدام محلول ACSF منخفض الصوديوم. بعد فصل رأس الفأر وإزالة الجلد عن الظهر، قم بإجراء قصين عبر الكتفين والنزول إلى القفص الصدري.بعد ذلك، يتم قطع الحبل الشوكي في أدنى نقطة ممكنة في القسم الذيلي لعزل العمود الفقري والأضلاع عن الجزء السفلي من الحيوان. اقلب العمود الفقري وأزل الأحشاء التي لا تزال ملتصقة بالأضلاع. انقل العمود الفقري إلى طبق بتري آخر أصغر حجماً ومملوء بالسيليكون.أضف سائل ACSF بارداً وقم بالترويق باستخدام غاز carbogen، واستخدم أربعة دبابيس حشرات لتثبيت النسيج بحيث يكون الجانب الظهري للأعلى. بعد ذلك، قم بإجراء عملية استئصال الصفائح الفقرية من الجانب الظهري عن طريق إدخال طرف مقص دقيق أولاً بين العظم والحبل الشوكي، وقطع العظم من الطرف المنقاري، مع الحرص على الابتعاد عن المادة البيضاء. قم بتبادل القطع على كل جانب مع استخدام الملاقط للإمساك بشريط العظم الذي تم قطعه بالفعل.بعد ذلك، استخدم ملاقط صغيرة لرفع الأم الجافية ومقصات صغيرة للقص على طول مسار الوصول المنقاري الذيلي على كلا الجانبين. تعد إزالة الأم الجافية خطوة حاسمة، لذا يفضل تخصيص بضع دقائق إضافية لإتمام هذه العملية بدقة.بمجرد إزالة الأم الجافية، استخدم طرفاً زجاجياً غير حاد لدفع الحبل الشوكي برفق نحو الجانب الأيسر من الأخدود المتكون نتيجة القطع النصفي للعمود الفقري. ثم اقطع الجذور البطنية والظهرية في الجانب المضيء لأبعد مسافة ممكنة من نقطة دخولها إلى الحبل الشوكي. كرر العملية على الجانب الأيسر، مع التحرك دائماً من الجهة الرأسية إلى الجهة الذيلية.بعد التشريح، قم بسحب الحبل الشوكي من العمود الفقري. ثم استخدم دبوس حشرات صغيرًا لتثبيت الحبل بحيث يكون السطح الظهري للأعلى. قم بإزالة أي قطع من الغشاء المتصل بعناية.بمجرد التنظيف، قم بتشذيب كلا طرفي الحبل الشوكي وأدخل دبوس حشرات منحنياً في الجزء الأمامي من الحبل لتحديد اتجاهه. ثم انقل الحبل الشوكي إلى محلول داخل خلوي مبرد بالثلج. بعد ذلك، قم بتبريد الآغار المصهور الذي تم تحضيره مسبقاً على خليط من الثلج والماء.قم بتحريك الآجار أثناء قياس درجة الحرارة. عندما تصل درجة حرارة الآجار إلى 38 °C، أمسك النخاع الشوكي بواسطة دبوس الحشرات واغمره في الآجار، بحيث يكون الجانب المنقاري للأسفل. تأكد من أن يكون النخاع الشوكي مستقيماً قدر الإمكان، وبعيداً عن الجدران، مع توجيه الجزء الذيلي للأعلى قليلاً.اترك الكأس في خليط الثلج والماء للسماح للأجار بالتصلب حول الحبل الشوكي بأسرع وقت ممكن. بعد التصلب، اقطع كتلة الأجار التي تحتوي على الحبل الشوكي بحيث تكون قاعدة الكتلة بزاوية 35 درجة مع الجزء القطني من الحبل. يجب أن يكون السطح الظهري موجهاً بعيداً عن القاعدة.قم بلصق الكتلة داخل حجرة جهاز المقطاع الاهتزازي (vibratome)، باستخدام غراء السيانوأكريليت. من الضروري تثبيت الكتلة بشكل صحيح للحفاظ على استمرارية الحزم الحركية مع الجذور البطنية التي تخرج منها. ثم اغمر الكتلة في محلول غلوكونات البوتاسيوم.اضبط معاملات جهاز المقطاع الاهتزازي (vibratome). بعد ذلك، قم بقطع شرائح بسمك 350 400 ميكرون من المنطقة القطنية، والتي يمكن تمييزها من خلال انحنائها وقطرها الأكبر. انقل الشرائح المناسبة إلى سائل ACSF عند درجة حرارة 34 درجة مئوية.عادةً ما تكون هناك أربع إلى خمس شرائح مناسبة تمتد فيها الجذور البطنية بمقدار 2 mm أو أكثر. وبعد مرور 30 دقيقة تقريبًا عند درجة حرارة 34 °C، يتم تبريد الشرائح إلى درجة حرارة الغرفة، ثم تبدأ جلسة التسجيل. قم بتجهيز صندوق يحتوي على ماصات متنوعة تتراوح أقطار رؤوسها من 40 إلى 170 microns مسبقًا.لتحضير ماصات القطاعات، اختر ماصات ذات فوهة طويلة. ثم، باستخدام سكين ماسي، قم بإجراء شقوق في مواضع مختلفة، وتحت مجهر تشريحي، اكسر كل ماصة عن طريق ضرب الطرف بملقط. بعد ذلك، قم بإزالة الغرفة من مجهر التسجيل وضعها تحت مجهر تشريحي.اختر شريحة تحتوي على جذر بطني بطول كافٍ ليتم تثبيته على قطب تحفيز بالامتصاص. قم بتثبيت الشريحة مع توجيه الجذور البطنية للأعلى، ثم اقطع الآجار بدقة حول الجذور البطنية مع ترك باقي الآجار حول الشريحة، وضع الشبكة لتثبيت العينة في مكانها. أعد تركيب الحجرة على المجهر وقم بتروية حجرة التسجيل باستمرار بسائل ACSF بمعدل 1 إلى 2 ملليلتر في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة.باستخدام ماصة زجاجية مملوءة بـ ACSF ومتصلة بمحقنة، قم بشفط أحد الجذور البطنية. ولتحقيق تحفيز جيد للجذر البطني، يجب أن يكون طرف الماصة محكماً حول الجذر البطني. قم بإجراء تسجيل patch-clamp لنوع الخلية المطلوب، وسجل تأثير تحفيز الجذر البطني كما تم وصفه سابقاً.تُظهر هذه الصورة النتائج المستخلصة من تسجيل تثبيت الجهد. تم أخذ التسجيلات في اللوحات العلوية من عصبونات حركية مختلفة عن تلك الموجودة في اللوحات السفلية. تُظهر اللوحة العلوية الاستجابة المرتدة للعصبون الحركي لتحفيز بقوة 1 V باللون الأحمر، وتحفيز بقوة 5 V باللون الأسود.يظهر المخطط السفلي استجابة جهد الفعل المتجه نحو الطرف (orthodromic) لتحفيز بقوة 20 فولت باللون الأحمر، وتحفيز بقوة 30 فولت باللون الأسود. وتشير النقاط السوداء إلى توقيت التحفيز. وتؤكد رؤوس الأسهم المزدوجة الفرق في فترات الكمون بين النبضات المتجهة نحو الطرف (orthodromic) وتلك المتجهة عكسياً (antidromic).تظهر هنا تسجيلات تثبيت التيار (current clamp). يوضح اللوح العلوي الاستجابة تراجعية الاتجاه (antidromic) لتحفيزات بقوة 10 فولت و15 فولت باللونين الأحمر والأسود على التوالي. ويوضح اللوح السفلي الاستجابة موجبة الاتجاه (orthodromic) لتحفيزات بقوة 25 و40 فولت باللونين الأحمر والأسود على التوالي.مرة أخرى، تم توضيح توقيت التحفيز والاختلافات في فترات الكمون. تم الحصول على هذه الصورة لمجموعة خلايا رينشو (Renshaw cell pool) باستخدام مكثف مائل وعدسة شيئية بقوة 20x. لاحظ اندماج محاور العصبونات الحركية في الجذر البطني كما يظهر بالسهم.التُقطت هذه الصورة للمنطقة نفسها باستخدام عدسة شيئية بقوة 40x. تشير رؤوس الأسهم إلى خلايا رينشو (Renshaw cells) المفترضة. يظهر هنا تسجيل تثبيت الجهد (voltage-clamp) لخلية رينشو عقب تحفيز الجذر البطني، والمشار إليه بالنقطة السوداء.منع وجود QX-314 في المحلول داخل الخلايا الخلية من إطلاق السيالات العصبية، كما تم حجب استجابات glycine و gaba بواسطة 3 micromolar من gabazine و one micromolar من strychnine، على التوالي. يمثل الخط الأحمر متوسط الخطوط الرمادية. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون 20 أو 30 دقيقة.أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر الحفاظ على التحضير في وسط بارد طوال الوقت. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير شرائح مائلة من النخاع الشوكي مناسبة لتحفيز الجذور البطنية. يمكن استخدام تحفيز الجذور البطنية لتأكيد الهوية العصبية الحركية بسهولة، والأهم من ذلك، لتحفيز الخلايا البطنية بشكل موثوق.

the-preparation-oblique-spinal-cord-slices-for-ventral-root

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

ونحن تصف إجراءات لإعداد وتسجيل الكهربية من شرائح المخ التي تحافظ على محور ظهري، بطني من القشرة المخية الأنفية الداخلية وسطي (MEC). لأن الترميز العصبية من موقع يتبع منظمة ظهري، بطني داخل مجمع الشرق الأوسط، هذه الإجراءات تسهيل التحقيق في الآليات الخلوية مهم للملاحة والذاكرة.

إعداد شرائح مجاور للسهمي للتحقيق في ظهري، بطني منظمة من القشرة المخية الأنفية الداخلية القوارض الإنسي

يصف هذا الفيديو التسجيل داخل الخلايا في الجسم الحي للخلايا العصبية الحركية للفئران تحت تحفيز التيار المباشر عبر العمود الفقري. يصف البروتوكول كيفية قياس خصائص الغشاء وتسجيل الإطلاق الإيقاعي للخلايا العصبية الحركية قبل وأثناء وبعد الاستقطاب النوعي أو الكاثودي للحبل الشوكي.

تحفيز التيار المباشر عبر العمود الفقري للخلايا العصبية الحركية للفئران

يوضح هذا الفيديو فحصا قائما على مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة لدراسة نشاط الشبكة العصبية في أقسام الحبل الشوكي للفأر. أولا ، يتم تسجيل النشاط الفيزيولوجي الكهربي من القرن الظهري السطحي (SDH) للشريحة. بعد ذلك ، يتم إدخال مثبط قناة البوتاسيوم لإطالة إزالة الاستقطاب ، مما يؤدي إلى نشاط إيقاعي متزامن عبر الشبكة العصبية.

التقييم القائم على مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة للشبكات العصبية في شرائح الحبل الشوكي للفأر

يعد تسجيل تيارات Ca2+ في غشاء وجه الإطلاق قبل المشبكي مفتاحا لفهم دقيق لدخول Ca2+ وإطلاق الناقل العصبي. نقدم تفككا حادا للحبل الشوكي اللامبري الذي ينتج محاور شبكية نخاعية معزولة وظيفية ، مما يسمح بالتسجيل مباشرة من غشاء الوجه المطلق لأطراف ما قبل المشبك الفردية.

التفكك الحاد من الجلكى الشبكي المحاوير لتمكين تسجيل من الإصدار الوجه غشاء من محطات قبل المشبكي الوظيفية الفردية

&lt; p class = 'jove_content'&gt;تعتمد فعالية الامتصاص العضلي والنقل الرجعي للجزيئات إلى الخلايا العصبية الحركية المقابلة على موقع مواقع الحقن فيما يتعلق بألواح نهاية المحرك (MEPs). هنا ، نصف كيفية تحديد موقع MEPs على عضلات الهيكل العظمي لتحسين النقل الرجعي للمتتبعات إلى الخلايا العصبية الحركية.

الحقن في العضل وإلى جانب لوحات السيارات نهاية: نهج المناظير لمكوك الراسمات مباشرة إلى الخلايا العصبية للسيارات

هنا، نحن تصف الخطوات الأساسية لتسجيلات المشبك تصحيح كامل الخلية من الخلايا العصبية في الدماغ جيلاتينوسا (سان جرمان) في شريحة الحبل الشوكي في المختبر . يسمح هذا الأسلوب خصائص الغشاء الجوهرية وانتقال متشابك وتوصيف الخصائص المورفولوجية سان جرمان الخلايا العصبية دراستها.

إعداد شرائح الحبل الشوكي الحاد لتسجيل كامل الخلية التصحيح-المشبك في الخلايا العصبية جيلاتينوسا الدماغ

هذا البروتوكول على حد سواء بصريا يتصل إعداد الحبل الشوكي الدماغ وتوضح إعداد شرائح عرضية جذع الدماغ بطريقة تدريجية شاملة. أنه صمم لزيادة إمكانية تكرار نتائج وتعزز احتمال الحصول على شرائح قابلة للاستمرار، وطويلة الأمد، إيقاعي نشطة لتسجيل الإخراج العصبية من مناطق الدماغ الجهاز التنفسي.

إعداد نشط إيقاعي في الحبل الشوكي الدماغ القوارض الولدان المختبر وشريحة رقيقة

يصف هذا البروتوكول في التسجيل داخل الخلايا الجسمية للورذان القطنية مع التحفيز المباشر المباشر عبر العمود الفقري المتزامن. الطريقة تمكننا من قياس خصائص الغشاء وتسجيل اطلاق إيقاعي من ال motoneurons قبل وأثناء وبعد الاستقطاب anodal أو cathodal من الحبل الشوكي.

في تسجيل داخل الخلايا في الجسم من نوع تحديد الفئران موتونيورونات العمود الفقري خلال عبر العمود الفقري التحفيز المباشر للتيار

يتم قياس تكامل المدخلات المتشابكة المتنوعة إلى الخلايا العصبية على أفضل نحو في إعداد يحافظ على جميع النوى قبل متشابك التوقيت الطبيعي ولدونة الدائرة، ولكن شرائح الدماغ عادة قطع العديد من الاتصالات. قمنا بتطوير شريحة الدماغ المعدلة لمحاكاة في نشاط الدائرة الجسمية مع الحفاظ على القدرة على التجريب في المختبر.

في في المختبر إسفين شريحة التحضير لتقليد في اتصال الدائرة العصبية فيفو

يتم تحديد الاستخدام المشترك لتكنولوجيا مصفوفة microelectrode والتحفيز الكيميائي الناجم عن 4-aminopyridine للتحقيق في نشاط مسبب للألم على مستوى الشبكة في القرن الظهري للحبل الشوكي.

تسجيل نشاط الشبكة في الدوائر الحساسة للألم في العمود الفقري باستخدام صفائف الأقطاب الدقيقة

يصف هذا البروتوكول طريقة تستخدم مشبك رقعة لدراسة الاستجابات الكهربائية للخلايا العصبية الحركية لتحفيز الحبل الشوكي (SCS) بدقة زمانية مكانية عالية ، والتي يمكن أن تساعد الباحثين على تحسين مهاراتهم في فصل الحبل الشوكي والحفاظ على صلاحية الخلية في وقت واحد.

التحضير خارج الجسم الحي لشريحة الحبل الشوكي لتسجيل المشبك التصحيحي للخلية الكاملة في الخلايا العصبية الحركية أثناء تحفيز الحبل الشوكي

تعلم طريقة تحضير شرائح مائلة من الحبل الشوكي في الفئران الصغيرة لتحفيز الجذور البطنية. تتيح هذه التقنية تحديد الخلايا الحركية ودراسة الخلايا البطنية التي تتغذى منها.

لإعداد المائل الحبل الشوكي شرائح لبطني الجذر تحفيز

استكشف المزيد من الفيديوهات