إنشاء وزرع للخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية (ASC) ورقة في نموذج التئام السكري

الهدف العام من هذا الإجراء هو التحقق من تأثير صفائح الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون جنبا إلى جنب مع الجلد الاصطناعي على التئام الجروح لعيب جلدي كبير كامل السماكة في الفئران السكرية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول التئام الجروح المزمنة ، مثل الجرح الكبير السكري مع العظام المكشوفة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الخلايا يتم زرعها في الجرح في صفائح صلبة باستخدام تقنية صفائح الخلايا ، والنتيجة هي عملية زرع قابلة للحياة ومستقرة.

بالنسبة للمتبرع بالفوطة الدهنية ، خطط لاستخدام فئران لويس البالغة من العمر ثمانية إلى 33 أسبوعا. في موقع الجراحة ، قم بتجهيز العديد من أدوات التطبيق المعقمة ذات الرؤوس القطنية ، والشاشات ، والمشرط ، وحامل الإبرة ، ومقص التشغيل ، وزوج من الملقط ، وخياطة النايلون 5-0. لوضع الأنسجة مؤقتا ، قم بتحميل طبق بتري سعة 100 مل مع 10 مل من PBS.

قم بوزن الطبق المحمل بنظام PBS للعثور لاحقا على كتلة الأنسجة المحصودة. بعد تخدير الفئران ، ضعه على ستارة معقمة. بعد ذلك ، احلق منطقة الجراحة وافرك الجلد المكشوف باستخدام عدة مقشرات متناوبة بنسبة 70٪ من الإيثانول.

الآن ، قم بعمل شق جلدي بطول ثلاثة سنتيمترات في أسفل البطن الجانبي. بعد ذلك ، قم بفضح وتشريح العضلات المائلة الخارجية. بعد ذلك ، قم بكشف الأنسجة الدهنية البربخية المحيطة بالبربخ.

بعد ذلك ، قم باستئصال الأنسجة الدهنية البربخية بعناية. تجنب إتلاف البربخ والخصيتين والأوعية الدموية البربخية. نقل الأنسجة إلى طبق PBS.

بعد ذلك ، أغلق الجرذ المتبرع واتبع ممارسات الرعاية القياسية بعد الجراحة. اعزل ASCs من جرامين إلى ثلاثة جرامات من الأنسجة الدهنية المحصودة. هضم الأنسجة لمدة ساعة في 0.1٪ من النوع A الكولاجيناز للحصول على جزء الأوعية الدموية اللحمية ، أو SVF.

بعد تنقية SVF ، قم بتعليق SVF في 20 مل من الوسائط. قسم التعليق إلى طبقين للثقافة بمساحة 60 سم مربع ، وقم بزراعتهما لمدة 24 ساعة في ظل الظروف القياسية. في اليوم التالي ، اغسل الأطباق باستخدام PBS ثلاث مرات لإزالة أي خلايا وحطام غير متصل.

بعد الغسيل النهائي ، أضف الوسط الكامل الطازج مرة أخرى. بعد ذلك ، استمر في مرور الخلايا حتى تصبح شبه متقاربة في اليوم الثالث من الزراعة. ثم ، باستخدام مليلتر واحد من 0.25٪ تريبسين EDTA في حضانة قصيرة.

قم بإزالة الخلايا من اللوحة. لا تدع الخلايا تتعرض للتربسين النشط لأكثر من 10 دقائق. بعد مراقبة الخلايا وعدها ، قم بزراعتها الفرعية بكثافة 1،700 لكل سنتيمتر مربع.

ثم مرر الزنازين كل ثلاثة أيام ، وأكمل ثلاثة مقاطع قبل المتابعة. بعد اجتياز ASCs للفئران المستزرعة للمرة الثالثة ، ضع 150،000 خلية على طبق ثقافة مستجيب لدرجة الحرارة قطره 35 ملم ، ومليلترين من وسط الاستزراع. استزراع الطبق لمدة ثلاثة أيام في حاضنة لعمل ورقة خلية موحدة.

بعد ثلاثة أيام ، قم بتغيير الوسط ، وأضف 16.4 ميكروغرام لكل مليلتر من AA. ثم قم بزراعة الخلايا ، وقم بتغيير وسط AA كل يومين. بعد أربعة أو خمسة أيام على الوسط المحتوي على AA ، تحقق من انتشار ASCs. ابحث عن الفجوات بين الخلايا وورقة الخلية المتجاورة.

بمجرد إنشاء ورقة خلية متجاورة ، يمكن استخدام الخلايا للنموذج. عند الحاجة ، اجمع ورقة الخلية عن طريق وضع اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 إلى 20 دقيقة. نظرا لأن اللوحة حساسة لدرجة الحرارة ، فسوف تنفصل الخلايا تلقائيا كورقة متجاورة ، ويمكن إزالة الورقة بالملقط.

بالنسبة لنموذج التئام الجروح السمنة ، استخدم ذكور الفئران ZDF البالغة ، التي تتراوح أعمارها بين 16 و 18 أسبوعا ووزنها بين 500 و 600 جرام. ضع الفئران وتخديرها في المجال الجراحي ، وقبل حلق الرأس ، قم بتنظيفها باستخدام 70٪ من الإيثانول. بعد ذلك ، احلق منطقة الجراحة ونظف الجلد المكشوف بمقشر متناوب بنسبة 70٪ من الإيثانول.

في هذا الوقت تقريبا ، انقل الصفيحة الحساسة لدرجة الحرارة للخلايا الجذعية الدهنية إلى المقعد. قبل أن تنفصل ورقة الخلية عن اللوحة ، قم بإزالة الوسيط وغسل ورقة الخلية باستخدام PBS ثلاث مرات. بعد جمع ورقة الخلية ، انقعها في PBS لحين الحاجة.

بمجرد أن تصبح الخلايا جاهزة ، قم بعمل عيب جلدي كامل السماكة 15 × 10 ملم على رأس الفئران. أولا ، قم بإزالة الأنسجة الجلدية وصولا إلى السمحاق. ثم استئصال الجلد من الأنسجة الجلدية بمشرط ومقص جراحي.

لإكمال العيب ، قم بإزالة السمحاق باستخدام السمحاق السمحاقي. ثم ضع ورقة الخلية فوق العيب. ورقة الخلايا الجذعية ناعمة ومرنة.

استخدم ملقط لتمديده إلى كل ركن من أركان العيب. الآن ، قم بتغطية ورقة الخلية والعيب برقعة 10 × 15 ملم من الجلد الاصطناعي المنقوع في المحلول الملحي قبل الاستخدام مباشرة ، وأغلق الجرح بحوالي 10 غرز باستخدام خياطة نايلون 5-0. لحماية الجرح ، استخدم خياطة نايلون 5-0 لتأمين رقعة 15 × 20 ملم من الضمادة غير اللاصقة على الجلد الصناعي.

خطط لمراقبة الضمادة كل يومين ، لأن الفئران ستزيلها دائما ، وإذا لزم الأمر ، استبدل الضمادة على الفور. في مجموعتين من ستة فئران دهنية مصابة بالسكري من زوكر ، تم استخدام البروتوكول الموصوف لإحداث عيب في الجمجمة. عولجت الفئران التجريبية بورقة خلايا جذعية دهنية للفئران ، ولم تكن الضوابط كذلك.

بعد 14 يوما ، كانت جروح مجموعة العلاج أصغر بكثير من جروح الضوابط. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عمل جرح كبير بالعظام المكشوفة في الفئران ، ثم علاج هذا الجرح بالخلايا الجذعية المشتقة من الدهون. أثناء محاولة هذا الإجراء ، تأكد من استخدام إدارة صارمة لدرجة الحرارة أثناء العملية الكاملة لاستخدام أطباق الثقافة المستجيبة لدرجة الحرارة.

خلاف ذلك ، يمكن أن تنفصل الخلايا تلقائيا عن الأطباق ، مما يؤخر تجاربك.