جيل من اللونين مستضد ميكروأرس للكشف في وقت واحد من مفتش والغلوبولين المناعي الأجسام المضادة الذاتية

الهدف العام من هذه التقنية هو الفحص السريع للأجسام المضادة الذاتية بطريقة متعددة الإرسال (multiplex). يمكن أن تساعد هذه الطريقة في تحديد الأسئلة الرئيسية في مجال المناعة الذاتية، مثل تحديد أي من الأجسام المضادة الذاتية ترتبط بحالات مرضية مختلفة. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية فحص الأجسام المضادة الذاتية بشكل متوازٍ، والحاجة فقط إلى ميكرولترات من المصل، وميكروجرامات فقط من المستضد.

لإنشاء مصفوفات مجهرية للمستضدات، ابدأ بتخفيف المستضدات في PBS وصولاً إلى تركيز نهائي قدره 2 mg/mL. قم بإعداد تكوين لجهاز الطباعة المصفوفية المجهرية (micro arrayer) باستخدام تسعة دبابيس لطباعة ما يصل إلى 162 مستضداً فريداً في مكررات ثنائية. قم بتضمين مستضدات IgG وIgM في مكتبة المستضدات كضوابط إيجابية.

أضف PBS فقط كعنصر تحكم سلبي. أضف 20 µL من كل مستضد إلى لوحة المصدر ذات 384 بئرًا في مجموعات تعكس إعداد رأس الطباعة. استخدم رقائق الألومنيوم لتغطية لوحة المصدر، وجمّد اللوحة عند -80 °C، حتى يحين وقت طباعة المصفوفات.

قم بتنظيف دبابيس المصفوفة الدقيقة الصلبة عن طريق تحضينها في حمام سونيك (sonicating bath) يحتوي على ماء منزوع الأيونات ثلاث مرات لمدة دقيقة واحدة في كل مرة. ضع الدبابيس في حامل لتجف، ثم رتب الدبابيس في رأس طباعة المصفوفة الدقيقة.

بالنسبة لتسعة دبابيس، استخدم تكويناً بمقاس ثلاثة في ثلاثة. بعد ذلك، قم ببرمجة جهاز المصفوفات الدقيقة (microarrayer) لعملية الطباعة من خلال ضبط عدد الدبابيس في رأس الطباعة، وعدد الشرائح المراد طباعتها، وعدد منصات التثبيت في كل شريحة، وعدد البقاع المكررة لكل مستضد. بالإضافة إلى ذلك، قم ببرمجة جهاز المصفوفات الدقيقة لإجراء عملية تنظيف بالسونيكيت (sonicate) للدبابيس في الماء بين المجموعات المختلفة من المستضدات.

بعد ذلك، وبعد إذابة اللوح المصدر، قم بطرده مركزياً لمدة دقيقة واحدة عند 100 ×g. ضع اللوح المصدر في الموضع المخصص له في جهاز المصفوفات الدقيقة (microarrayer)، ثم قم بإزالة جزء القصدير الذي يغطي المجموعة الأولى من المستضدات المراد طباعتها. رتب الشرائح غير المطبوعة على سطح جهاز المصفوفات، ثم قم بتشغيل برنامج الطباعة. اطبع الشرائح في درجة حرارة الغرفة مع ضبط الرطوبة في جهاز المصفوفات على 55 إلى 60%. بعد طباعة كل مجموعة من المستضدات على جميع الشرائح، قم بإيقاف جهاز المصفوفات الدقيقة مؤقتاً.

قم بتغطية المستضدات التي تم طباعتها للتو برقائق الألمنيوم لمنع التبخر، ثم اكشف عن المجموعة التالية من المستضدات المراد طباعتها. بعد ذلك، تابع برنامج الطباعة. بعد طباعة جميع المستضدات، قم بتغطية لوحة المصدر بقطعة جديدة من رقائق الألمنيوم، وجمدها عند درجة حرارة -80 °C.

ضع الشرائح المطبوعة في صندوق شرائح، ثم أغلقه بإحكام باستخدام التفريغ الهوائي. يمكن استخدام الشرائح في اليوم التالي، أو خلال فترة تصل إلى شهر واحد. لفحص المصفوفات الدقيقة باستخدام أمصال مخففة عبر غرف التحضين، ضع الشرائح داخل الإطارات.

ثم أضف 700 µL من محلول الحجب (blocking buffer) إلى سطح كل مصفوفة. ضع الغشاء اللاصق فوق الإطار وانقله إلى حاوية محكمة الإغلاق تحتوي على قطعة من المناديل الورقية المبللة. بعد ذلك، حضّن الشرائح عند درجة حرارة 4 °C على هزاز (rocker) طوال الليل.

في اليوم التالي، يتم تخفيف عينات المصل بنسبة 1 إلى 100 في محلول الحجب. ثم يتم سحب محلول الحجب من المصفوفات، وإضافة 500 µL من العينة المخففة إلى سطح كل مصفوفة. بعد ذلك، تُغطى المصفوفات بفيلم لاصق، وتُحضن عند درجة حرارة 4 °C مع الهز لمدة ساعة واحدة.

بعد ذلك، يتم سحب عينات المصل من المصفوفات، واستخدام محلول غسل لشطف أسطح المصفوفات أربع مرات عن طريق صب المحلول على الشرائح ثم التخلص منه بسرعة عن طريق الهز. استخدم 700 µL من محلول الحجب لغسل كل سطح من أسطح المصفوفات، ثم يتم التحضين لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع التحريك المستمر. بعد ذلك، أضف 500 µL من الأجسام المضادة الثانوية المخففة إلى سطح كل شريحة، وقم بتغطيتها باستخدام فيلم لاصق.

تُحضن الشرائح عند درجة حرارة 4 °C مع التحريك لمدة 45 دقيقة. وبعدما تنتهي فترة التحضين، يُشفط خليط الأجسام المضادة الثانوية من الشرائح وتُشطف أربع مرات، كما تم توضيحه للتو. ثم تُغسل الشرائح باستخدام 700 µL من محلول التخفيف الحاجب، ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة.

قم بإزالة الشرائح من الإطارات، ثم ضعها في حامل شرائح معدني، واغمرها في PBS. تُحضن في درجة حرارة الغرفة مع الرج المداري لمدة 20 دقيقة. ضع حامل الشرائح في وعاء يحتوي على ماء منزوع الأيونات لمدة 15 ثانية.

ثم ضع الحامل في وعاء جديد من الماء، واتركه للحضن لمدة 15 ثانية أخرى. ولتجفيف الشرائح، ضع حامل الشرائح على محول صفائح ELISA في جهاز الطرد المركزي، وقم بتدويره بسرعة 220 ×g في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ضع الشرائح في صندوق محكم ضد الضوء حتى يحين وقت المسح الضوئي.

لمسح الشرائح، استخدم ماسح المصفوفات الدقيقة الذي يمكنه اكتشاف إشارات الفلورسنت لـ SI three وSI five. حدد قيمة أنبوب المضاعف المثلى، أو إعدادات PMT، عن طريق إجراء مسح مسبق لشريحة مكتبة المستضدات الكاملة التي تم اختبارها باستخدام الأجسام المضادة الثانوية فقط. اضبط قيم PMT المستخدمة عن طريق الضغط على زر الجهاز بحيث يكون لسمات IgG البشرية في قناة SI three، وسمات IGM البشرية في قناة SI five، شدة فلورسنت وسيطة مطروحة منها الخلفية، أو MFIB، متقاربة، والتي تكون عادةً 40,000.

بعد ذلك، قم بمسح الشرائح التجريبية على القناتين بالضغط على زر المسح. احفظ صور الشرائح في كلتا القناتين بعد كل عملية مسح. وباستخدام زر الملف، قم بتحميل الشريحة المراد تحليلها في برنامج المصفوفات الدقيقة.

بعد ذلك، استخدم زر الملف لتحميل قائمة مصفوفة الجينات، أو ملف GAL، الذي يحتوي على تخطيط المصفوفة مع تعريفات سمات المصفوفة. ضع قالب المصفوفة فوق الصورة الممسوحة ضوئيًا، بحيث تتطابق سمات المصفوفات مع القالب قدر الإمكان. اضغط على زر المحاذاة لمحاذاة السمات في جميع الكتل مع القالب.

سيقوم البرنامج بعد ذلك بحساب متوسط شدة الفلورة (MFI) مطروحاً منها الخلفية لكل مستضد من المستضدات. وأخيراً، استخدم زر الملف لتصدير النتائج كملف نصي، ثم قم بتحليل البيانات وفقاً للبروتوكول النصي. في هذا الشكل، الذي يوضح شرائح التحكم الإيجابية والسلبية، تم فحص الشريحة السلبية باستخدام الأجسام المضادة الثانوية فقط، بينما تم فحص شريحة التحكم الإيجابية باستخدام مصل مأخوذ من مريض يعاني من مرض الذئبة الحمامية الجهازية.

كما هو موضح هنا، يظهر مصل التحكم الإيجابي، ذو التفاعلية المعروفة تجاه riboP، وجود أجسام مضادة من نوع IgM ضد DNA أحادي الخيط، وأجسام مضادة من نوع IgG ضد riboP. وقد لوحظت استجابات خطية مع IgM عبر جميع تخفيفات المصل، ومع IgG حتى قيمة MFI مطروحة منها الخلفية تبلغ 30,000 تقريباً. في هذه التجربة، يتم فحص المصفوفة باستخدام مصل بشري من مريض يعاني من التهاب الأوعية الدموية الكريوجلوبوليني، مع توثيق وجود عامل روماتويدي، وهو عبارة عن جسم مضاد من نوع IgM ضد IgG.

تظهر سمة IgG باللون الأصفر المخضر نتيجة ارتباط IgM في مصل المريض بـ IgG المثبت على المصفوفة. وعند استخدام الأجسام المضادة الثانوية وحدها، لا يُلاحظ أي تفاعل لـ IgM ضد IgG المُنقط على المصفوفة. وكما هو موضح هنا، فإن IgM و IgG الفأرية المُنقطة على المصفوفة يتم اكتشافها فقط باستخدام أجسام مضادة ثانوية مضادة للفئران خاصة بـ IgM و IgG على التوالي.

يوضح هذا الشكل محاذاة شبكة القالب على صورة مصفوفة ممسوحة ضوئياً، باستخدام برنامج تحليل المصفوفات الدقيقة. وبمجرد إتمام المحاذاة، يمكن تحليل ميزات المصفوفة للحصول على متوسط شدة الفلورسنس مطروحاً منها الخلفية لكل ميزة. وبمجرد إتقان العملية، يمكن إجراء سبر المصفوفات الدقيقة للمستضدات في غضون أربع ساعات إذا تم تنفيذ ذلك بشكل صحيح.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن إجراء تقنيات أخرى مثل ELISA من أجل التحقق من النتائج التي تم الحصول عليها من المصفوفات الدقيقة للمستضدات. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية طباعة المصفوفات الدقيقة للمستضدات، وكيفية سبر هذه المصفوفات باستخدام المصل، وكيفية مسح المصفوفات الدقيقة للمستضدات باستخدام الماسح الضوئي. لا تنسَ أن العمل مع المصل البشري قد يكون خطيراً، ويجب اتخاذ الاحتياطات العالمية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.