طرق لعزل والثقافة، وتوصيف الوظيفي للالجيبية الأذينية عقدة Myocytes من الفئران الكبار

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا العضلية للعقدة الجيبية الأذينية النشطة تلقائيا من الفئران لإجراء تجارب الفيزيولوجيا الكهربية أو التصوير قصيرة أو متوسطة المدى. تعتبر الخلايا العضلية للعقدة الجيبية الأذينية المعزولة مهمة لدراسة آليات تنظيم ضربات القلب ، ولا سيما دراسة التيارات الأيونية المحددة أو توقيت إطلاق الكالسيوم داخل الخلايا. لكن عددا قليلا نسبيا من المختبرات تستخدم الخلايا العضلية الجيبية الأذينية المعزولة من الفئران جزئيا لأنه من الصعب جدا تعلم الإجراء من الطرق المكتوبة وحدها.

بعد تحضير جميع الحلول المطلوبة للعزل ، قم بإزالة الفراء من صدر بالمقص. ثم قم بتمرير القفص الصدري لكشف تجويف الصدر باستخدام ملقط الأنسجة الخارجية ومقص التشريح. اشطف تجويف الصدر بملليلترين من Tyrode الكامل الدافئ بالهيبارين.

تحت مجهر تشريح ، قم بإزالة الرئتين والغدة الصعترية بعناية باستخدام مقص داخلي وملقط التشريح. أثناء الإمساك بقمة القلب برفق ، قم بقطع الوريد الأجوف السفلي والشريان الأورطي بعناية لإزالة القلب من تجويف الصدر. ثم انقل القلب إلى أحد أطباق تشريح السيليكون ثم اشطفه بملليلترتين إلى أربعة ملليلترات من Tyrode الكامل الدافئ

قم بتوجيه القلب بحيث تكون الأوعية الخلفية مرئية ومتجهة لأعلى. بعد ذلك ، قم بتثبيت القلب عن طريق تثبيته من خلال القمة في طبق تشريح السيليكون. بعد ذلك ، حدد موقع الأخدود بين البطينين والأذينين.

باستخدام مقص التشريح الداخلي ، قم بعمل شق في الأخدود مع إبقائه قريبا من البطينين. اغسل الأخدود والشق باستخدام Tyrode الكامل الدافئ الإضافي حسب الحاجة للسماح برؤية واضحة للأذينين والصمامات. ثم استمر في القطع على طول الأخدود لفصل الأذينين عن البطينين.

بعد ذلك ، انقل الأنسجة الأذينية إلى طبق تشريح السيليكون الثاني واشطفه بثلاثة ملليلتر من Tyrode الكامل الدافئ. بعد ذلك ، أثناء تمديد المستحضر برفق ، قم بتثبيت الأنسجة من خلال الوريد الأجوف السفلي. ثم اقلب الأنسجة بحيث يكون الأذين الأيمن للحيوان الآن على الجانب الأيسر للمجرب والأذين الأيسر على الجانب الأيمن من المجريب.

من المهم جدا الحصول على الاتجاه والتعرف عليه من أجل عزل الأنسجة الصحيحة. استمر في تثبيت الأنسجة من خلال الوريد الأجوف العلوي ، ثم الزوائد الأذينية اليمنى واليسرى. قم بإزالة أي دهون متبقية أو أنسجة أخرى للسماح برؤية واضحة للمستحضر.

بعد ذلك ، افتح الجدار الأمامي للأذينين عن طريق قطع الأجوف الوريدي. قم بتدوير الطبق حسب الضرورة لتشريح كل من الأجوف العلوي والسفلي. أعد وضع المسامير حسب الضرورة لتصور الحاجز الأذيني.

ثم قطع على طول الحاجز بين الأذين لإزالة الأذين الأيسر. أعد تثبيت المستحضر ، وقم بتمديده برفق ، وقم بإزالة الدهون من خلف العقدة الجيبية الأذينية. بعد ذلك ، قم بإزالة الزائدة الأذينية اليمنى ثم حرر العقدة الجيبية عن طريق القطع على طول المحطة الطرفية التي تظهر على شكل خط برتقالي داكن يحد الزائدة الأذينية.

أعد تثبيت الأنسجة العقدية أو قم بفكها وقم بقصها بشكل جانبي لإنتاج ثلاثة شرائح متساوية الحجم. في هذا الإجراء ، باستخدام الماصة الضيقة المصقولة بالنار ، انقل ثلاثة شرائط من أنسجة العقدة الجيبية الأذينية إلى أول الأنابيب السفلية الثلاثة الصغيرة المستديرة التي تحتوي على 2.5 مل من المغنيسيوم منخفض الكالسيوم Tyrode واحتضانها لمدة خمس دقائق. بعد خمس دقائق ، انقل شرائط الأنسجة إلى الأنبوب السفلي الدائري الصغير الثاني الذي يحتوي على 2.5 مل من المغنيسيوم منخفض الكالسيوم Tyrode's.

اغسل شرائط المناديل عن طريق تدوير الأنبوب برفق أو عن طريق سحب العينة برفق باستخدام الماصة الضيقة. لا تقلب الأنبوب. ثم انقل شرائط الأنسجة إلى الأنبوب السفلي الدائري الصغير الثالث الذي يحتوي على 2.5 مل من المغنيسيوم منخفض الكالسيوم Tyrode's وكرر خطوة الغسيل.

بعد ذلك ، انقل الشرائط إلى الأنبوب السفلي الدائري الكبير الذي يحتوي على 2.5 مل من المغنيسيوم منخفض الكالسيوم Tyrode مع الإنزيمات. امزج كل خمس دقائق عن طريق تحريك الأنبوب برفق. بعد هضم الإنزيم، استخدم ماصة ضيقة مصقولة بالنار لنقل شرائط الأنسجة برفق إلى أول الأنابيب السفلية المستديرة الثلاثة الصغيرة التي تحتوي على محلول KB المعدل.

ثم انقل الشرائط من خلال الأنابيب السفلية المستديرة الصغيرة الثانية والثالثة لغسل الأنسجة قبل نقلها إلى الأنبوب السفلي الدائري الكبير الذي يحتوي على محلول KB. باستخدام الماصة المصقولة الأكبر حجما بالنار ، قم بفصل الخلايا الموجودة في الأنبوب السفلي الدائري الكبير عن طريق التجربة المستمرة ، مع الحرص على إبقاء أنبوب التفكك مغمورا في الحمام المائي 35 درجة مئوية وتجنب إدخال الفقاعات في المحلول. لقد وجدنا أن الطرد القوي للمحلول بتردد واحد في الثانية تقريبا أو هرتز واحد يعمل بشكل أفضل.

أضف الآن 75 ميكرولترا من محلول التكيف مع كلوريد الصوديوم كلوريد الكالسيوم إلى الأنسجة. حركها برفق لخلطها واحتضانها لمدة خمس دقائق. استمر في إضافة الكالسيوم بزيادات كما هو موضح في البروتوكول المكتوب.

بعد إعادة تكيف الكالسيوم ، اجمع الخلايا العضلية الجيبية الأذينية عن طريق السماح لها بالاستقرار لمدة 10 دقائق أو عن طريق الطرد المركزي عند 2 ، 000 مرة جم لمدة ثلاث دقائق. بالنسبة للخلايا المعزولة بشكل حاد ، قم بإزالة حوالي خمسة ملليلتر من المادة الطافية والتخلص منها برفق باستخدام ماصة النقل. ثم قم بتخزين الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى ثماني ساعات لتجارب مشبك التصحيح.

بعد ذلك ، يمكن إجراء التقييمات الوظيفية للخلايا العضلية الجيبية الأذينية المعزولة باستخدام تسجيلات مشبك التصحيح لإمكانات العمل التلقائي والتيارات الغشائية. يمكن الحفاظ على الخلايا العضلية الجيبية النشطة تلقائيا في المزرعة لمدة تصل إلى ستة أيام. تحتفظ الخلايا المستنبتة بمورفولوجيا عامة تشبه إلى حد بعيد تلك الموجودة في الخلايا العضلية الجيبية المعزولة بشكل حاد مع عدم وجود تغييرات كبيرة في متوسط الطول أو العرض أو مساحة المقطع العرضي أو سعة الغشاء للخلايا المستنبتة مقارنة بالخلايا المعزولة بشكل حاد.

الخلايا مناسبة لمجموعة من الدراسات التجريبية مثل تسجيلات مشبك التيار والجهد. يظهر هنا كأمثلة على ذلك إمكانات العمل التلقائي والتيار المضحك. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال تشريح العقدة الجيبية والعزل وإعادة إدخال الكالسيوم في غضون ساعتين تقريبا حتى تتمكن من الحصول على خلايا جاهزة للذهاب لتجاربك.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن اتجاه الأنسجة أمر بالغ الأهمية لتشريح جيد وأنه يجب تحسين خطوات التفكك الأنزيمي والميكانيكي كما هو موضح في النص. بعد هذا الإجراء ، يمكن استخدام الخلايا العضلية للعقدة الجيبية الأذينية المعزولة في مجموعة متنوعة من التجارب بما في ذلك الفيزيولوجيا الكهربية أحادية الخلية وتصوير الكالسيوم والكيمياء المناعية. يمكن أيضا الحفاظ على الخلايا في الثقافة للتجارب التي تتطلب التلاعب الجيني أو التعبير عن جزيئات المراسل.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا العضلية الجيبية الأذينية عن الفئران البالغة. حظا سعيدا في تجاربك.