Adenofection: منهج في دراسة دور الجزيئية الوصيفات في الخلوي Morphodynamics من التجارب استنفاد الانقاذ
سبتمبر 16, 2016
نصف طريقة لتجارب النضوب والإنقاذ التي تحافظ على السلامة الخلوية وتوازن البروتين. يتيح Adenofection إجراء تحليلات وظيفية للبروتينات داخل العمليات البيولوجية التي تعتمد على الديناميكيات القائمة على الأكتين المضبوطة بدقة ، مثل انقسام الخلايا الانقسامية وتكوين العضلات ، على مستوى الخلية الواحدة.
الهدف العام من هذه الطريقة هو تمكين إجراء تجارب إنقاذ النضوب في ظل ظروف تحافظ على السلامة الخلوية وتوازن البروتين. للتحليلات الوظيفية للعمليات البيولوجية على مستوى الخلية الواحدة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بوظائف البروتين ومتطلبات الهيكل في ديناميكيات الخلية مثل الانقسام الفتيلي وتمايز الخلايا.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي استنفاد البروتين ذي الأهمية وإعادة الإدخال في نفس الوقت متغير هذا البروتين على المستوى الفسيولوجي الجديد في قياس مجموعة الخلايا. ابدأ بطلاء أطباق القاع الزجاجي بالفريبرونكتين. للقيام بذلك ، قم بتخفيف ملليغرام واحد لكل مليلتر من مخزون فيربرونكتين من واحد إلى 100 باستخدام PBS معقم.
أضف ملليلتر واحد إلى كل طبق سعة 35 ملليلتر لتغطية السطح بالكامل. احتضان لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. أثناء الحضانة ، تم استكمال مثيل ألفا الدافئ مسبقا بنسبة 10٪ FBS ونسبة 0.05٪ تريبسين EDTA إلى 37 درجة مئوية.
بعد 45 دقيقة من الحضانة ، ابدأ في تحضير محلول الخلية. استنشق الوسط من صفيحة 10 سم من خلايا HeLa RFP H2B. واشطف برفق مرتين باستخدام 1.5 مل من 0.05٪ تريبسين EDTA.
اترك 0.5 مل من التربسين EDTA على الطبق بعد الشفط الأخير. واحتضان الخلايا لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق عند 37 درجة مئوية. و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
اضغط برفق على اللوحة. وراقب طبقة الخلية تحت المجهر للتحقق من انفصال جميع الخلايا. ثم أضف 10 مل من الوسط والماصة برفق عدة مرات لفصل الخلايا ونقل تعليق الخلية في أنبوب سعة 15 ملليلترا.
عد عينة سعة 10 ميكرولتر من معلق الخلية باستخدام مقياس كثافة الدم. بعد ذلك ، قم بشفط محلول الفبرونيكتين من أطباق القاع الزجاجي. لا تدع الفيبرونيكتين يجف قبل طلاء الخلايا.
قم بإعداد محلول تعليق الخلية على اللوحة 1.5 مرة عشرة إلى الخلايا الخامسة لكل طبق 35 ملم في ملليلترين من المتوسط. لوحة واحدة 35 ملم إضافة إلى عدد الحالات من أجل حساب رقم الخلية قبل نقل الفيروس. احتضن لمدة 30 إلى 45 دقيقة.
بعد انقضاء وقت الحضانة ، افحص الخلايا الموجودة تحت المجهر للتأكد من فصل الخلايا جيدا. كما هو موضح هنا. أعد الصفائح إلى الحاضنة وقم بتنمية الخلايا حتى اليوم التالي.
في اليوم التالي للطلاء ، تأكد من أن الخلايا قد وصلت إلى كثافة لا تقل عن 50٪ تؤدي كثافة الخلايا الأقل من 50٪ إلى انخفاض كفاءة نقل الفيروس. زيادة التباين في التعبير عن البروتين لكل خلية ، وزيادة سمية الخلايا. ثم احصد الخلايا من الطبق المطلي الإضافي كما كان من قبل.
وحساب عدد الخلايا. احسب حجم الفيروسات المطلوبة لنقل الخلايا بكفاءة. قم بتسمية أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر لكل حالة.
وأضف 400 ميكرولتر من ألفا MEM الدافئ ناقص. بعد إذابة كميات الفيروسات ببطء على الجليد ، أضف الحجم المطلوب لكل فيروس إلى الأنابيب واخلطها برفق عن طريق سحب العينات. بعد ذلك ، بعد شفط الوسط من الخلايا ، أضف مزيج الفيروس برفق.
احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. كل 15 دقيقة لمدة ساعة واحدة ، حرك الصفائح بعناية تحت الغطاء المعقم لتغطية الخلايا بالفيروس. يسهل استخدام كمية صغيرة من الوسط ملامسة الفيروس للخلايا.
بعد الحضانة ، قم بعمل ماصة برفق 1.6 مل من alpha MEM ناقص كل لوحة للحصول على حجم إجمالي يبلغ ملليلترا. ثم ابدأ مزامنة الخلايا بإضافة اثنين من المليمولات ثيميدين قبل احتضان الخلايا لمدة ساعتين أخريين. وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد مزيج تعداء siRNA عن طريق إضافة 139 ميكرولتر من الماء المعقم في أنبوب دقيق ، و 50 ميكرولترا من كلوريد الكالسيوم المولي ، و 11 ميكرولترا من 20 ميكرومولار siRNA.
إذا لم يكن siRNA ضروريا ، فاستبدل كمية siRNA بالماء المعقم لإجراء تعداء فارغة. أضف محلول HBSS2X ببطء إلى خليط siRNA كلوريد الكالسيوم. امزج برفق مرتين عن طريق حقن الهواء باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر.
نظرا لأن الرواسب الأصغر تؤدي إلى كفاءة تعداء أفضل. ثم احتضن المزيج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، أضف ببطء 200 ميكرولتر إلى كل طبق وحركها للخلط.
احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 16 ساعة. في اليوم التالي ، قم بإزالة الأطباق من الحاضنة وانقلها إلى غطاء مزرعة الأنسجة. بعد شطف الخلايا مرتين بملليلترين من فرق الورن الدافئ ، أضف ملليلترين من ألفا MEM ناقص قبل العودة إلى الحاضنة.
بعد سبع ساعات ، أضف اثنين من المليمولات ثيميدين إلى الأطباق قبل إعادتها إلى الحاضنة. اعمل مع ما لا يزيد عن أربع ألواح خلوية في المرة الواحدة حيث تؤثر التغيرات في درجات الحرارة على طول دورة الخلية. في اليوم التالي ، بعد 48 ساعة من تعداء الحمض النووي الريبي وعدوى الفيروس ، اشطف الخلايا مرتين باستخدام ملليلترين من PBS الدافئ ثم أضف ملليلترين من ألفا MEM بدون فينول أحمر لتصوير الخلايا الحية.
احتضن لمدة سبع ساعات. قم بإجراء تجارب تصوير الخلايا الحية قصيرة المدى على الخلايا الانقسامية باستخدام مجهر مقلوب مجهز بغرفة منظمة حراريا بثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. قبل الاستحواذ ، تحقق من أن الغرفة قد وصلت إلى درجة الحرارة المناسبة البالغة 37 درجة مئوية.
ضع الأطباق المستزرعة في غرفة المجهر قبل ساعة واحدة من الاستحواذ لتمكين التوازن المناسب للوسط وتجنب انجراف التركيز بسبب التغيرات في درجات الحرارة. افحص الحالة الانقسامية للخلايا. في هذه المرحلة.
يجب أن تكون 10 إلى 15٪ من الخلايا في المراحل المبكرة من الانقسام. خلال وقت التوازن ، قم بإعداد معلمات الاستحواذ على النحو المحدد في التجارب السابقة. من المهم تحقيق الدقة المناسبة دون تبييض الصور.
لأن هذا يسبب تلف الخلايا ويزعج تطور الانقسام. اختر العديد من الحقول التي تحتوي على خلايا في دخول الانقسامي لكل شرط للحصول على عدد كبير من الخلايا لتحليلها دون تجاوز الفاصل الزمني للاكتساب. بمجرد اختيار جميع الحقول ، أعد تعيين التركيز وابدأ الاستحواذ في أسرع وقت ممكن.
يمكن أن يؤدي استخدام قرص دوار إلى نظام التركيز. سيتضمن الإعداد النموذجي أربعة شروط مختلفة. سبعة حقول لكل لوحة.
وقناتان ملونان بفاصل زمني من 1.5 إلى دقيقتين على مدى 75 دقيقة. تحديد معايير محددة جيدا لتحليل أنواع الفينو الانقسامية في الخلايا والتي ستعتمد على علامات الفلورسنت المستخدمة. على عكس تعداء BAG3 GFP ، فإن الحمض النووي البلازمي ، كما هو موضح على اليسار ، فإن التصاق بالفيروسات الغدية المعاد تأهيلها الموضحة هنا على اليمين يتيح تعبيرا أكثر تجانسا وكفاءة عن BAG3 GFP.
في أغلبية من الخلايا السكان في تعدد منخفض من العدوى. تظهر هذه اللطخة الغربية التمثيلية أن الالتصاق مع siRNAs الخاصة ب BAG3 والفيروس الغدي BAG3 GFP يسمح بالانفاذ الفعال ل BAG3 الداخلي وإعادة إدخال بروتين BAG3 GFP عند مستويات قريبة من الداخلية. كما هو موضح هنا ، يمكن أن يحافظ adenofection على توازن البروتين نظرا لعدم وجود زيادة يمكن اكتشافها في مستويات بروتينات الصدمة الحرارية الناجمة عن الإجهاد في خلايا HeLa التي تم إلتصاقها.
على عكس خلايا HeLa المعالجة بمحفز الإجهاد السام البروتيني ، MG132. نرى هنا أن تطور الخلايا من خلال الانقسام لا ينزعج بشكل كبير بسبب الالتحاق كما هو موضح في هذه الصور ذات الفاصل الزمني البؤري من خلايا HeLa الملتصقة بالتحكم siRNA و BacMam GFP alpha Tubulin. و BacMam FRP أكتين.
يشير الرسم البياني إلى نسبة الخلايا ذات الانقسام غير الطبيعي. أظهرت الخلايا الملتصقة ب BAG3 siRNA الخاص وحدها زيادة تقريبية بمقدار ضعفين في مستوى العيوب الانقسامية. كما هو موضح في الشريط الأحمر.
والتي تمت استعادتها إلى ما يقرب من مستوى خلية التحكم عن طريق إعادة إدخال BAG3 GFP الموضح بالشريط الأسود. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تجارب إنقاذ النضوب باستخدام adenofection. توفر هذه الطريقة نظاما سريعا وبسيطا لإنشاء ضربات قاضية ناقص الشكل لتحليل وظيفة الهيكل في خلفيات خلوية متعددة.
باتباع هذه الطريقة ، يمكن تحديد المتطلبات الهيكلية الرئيسية للبروتين ذي الأهمية لوظيفة معينة. يمكن بعد ذلك استخدام مناهج أخرى لتحرير الجينوم لتعميق الآليات المعنية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة طريقة لإجراء تجارب استعادة الاستنزاف التي تحافظ على سلامة الخلايا وديناميكيات البروتين. تتيح هذه التقنية إجراء تحليلات وظيفية للبروتينات المتورطة في العمليات البيولوجية الحيوية، مثل الانقسام الخلوي وتشكل العضلات، على مستوى الخلية الواحدة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- بيولوجيا الخلية
- ديناميكيات البروتين
- سلامة الخلية
الخلفية
- تجارب استعادة الاستنزاف ضرورية لدراسة وظائف البروتينات.
- الحفاظ على سلامة الخلية أمر بالغ الأهمية للحصول على نتائج دقيقة.
- الديناميكيات القائمة على الأكتين تلعب دورًا مهمًا في انقسام الخلايا وتمايزها.
- تتيح هذه الطريقة إعادة إدخال متغيرات البروتينات على المستويات الفسيولوجية.
هدف الدراسة
- لتمكين تجارب استعادة الاستنزاف تحت ظروف تحافظ على سلامة الخلية.
- لتحليل وظائف البروتينات والمتطلبات الهيكلية في ديناميكيات الخلية.
- للتحقيق في العمليات البيولوجية على مستوى الخلية الواحدة.
الطرق المستخدمة
- تغليف الأطباق الزجاجية ذات القاع بالفيبرونيكتين.
- تخفيف مخزون الفيبرونيكتين باستخدام PBS معقم.
- استنزاف بروتين ذي أهمية مع إعادة إدخال متغير.
- قياس التأثيرات على مجموعة الخلايا.
النتائج الرئيسية
- نجحت الطريقة في الحفاظ على سلامة الخلية أثناء التجارب.
- تكشف التحليلات الوظيفية عن رؤى حول ديناميكيات البروتين.
- يتم معالجة الأسئلة الرئيسية المتعلقة بوظائف البروتينات.
- توفر تحليلات مستوى الخلية الواحدة فهمًا مفصلًا لعمليات الخلية.
الاستنتاجات
- تعد هذه الطريقة مفيدة لدراسة وظائف البروتينات في الخلايا الحية.
- تتيح إمكانية التلاعب الدقيق بمستويات البروتين.
- يمكن أن تعزز هذه التقنية فهمنا للعمليات البيولوجية الحيوية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Adenofection enables depletion-rescue experiments that preserve cellular integrity and protein homeostasis, addressing a key challenge in studying proteins involved in cytoskeletal dynamics. By achieving near-physiological protein reintroduction without triggering stress responses, the method supports reliable functional analysis in discovery settings. This approach enhances predictive confidence in target validation for processes like mitosis and differentiation, where morphological readouts are critical.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of protein function and structural requirements in mitosis and cell differentiation through controlled depletion and rescue.
- Operational Value: Achieves homogeneous protein expression in >75% of cells at near-endogenous levels, reducing variability in phenotypic readouts.
- Strategic Value: Supports target de-risking by linking molecular chaperones like BAG3 to cytoskeletal remodeling without confounding stress responses.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates live-cell imaging of mitotic dynamics with fluorescent markers, enabling quantitative assessment of division phenotypes.
- Operational Value: Compatible with hard-to-infect mouse cells and myoblast differentiation models, broadening assay applicability across systems.
- Strategic Value: Provides a reusable platform for structure-function analysis of cytoskeletal regulators in phenotypic screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains near-normal mitotic progression, ensuring that observed phenotypes reflect target-specific effects rather than experimental artifacts.
- Operational Value: Preserves endogenous Heat Shock Protein levels, indicating minimal disruption to protein homeostasis networks.
- Strategic Value: Enables mechanistic de-risking of targets involved in actin-dependent processes prior to preclinical investment.
Pipeline & Workflow Integration
Adenofection fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization, particularly for targets where cellular morphology and dynamics are functional readouts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling precise modulation of chaperone proteins in dividing cells.
- Screening: Generates reproducible, quantitative outputs via time-lapse microscopy of mitotic defects and rescue.
- Analytics: Delivers measurable phenotypic readouts (e.g., proportion of abnormal mitoses) to compare conditions and assess target impact.
- Translational Research: Bridges functional validation in mitotic cells to preclinical models like myoblast differentiation, supporting continuity of evidence.
- Enterprise Reuse: Establishes a adaptable method for studying any protein of interest in sensitive, morphology-dependent processes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating target-specific effects on cytoskeletal dynamics through depletion-rescue design.
- Operational Value: Standardizes protein expression levels across cell populations, improving assay consistency and reducing noise.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by providing physiologically relevant functional data early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated roles in critical cellular processes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in viral transduction, siRNA transfection, and live-cell imaging.
- Needs access to recombinant adenovirus production and fluorescence microscopy systems.
- Demands standardization of transduction timing and siRNA dosing across experimental conditions.
- Involves optimization for different cell types, particularly primary or hard-to-transfect lines.
- Limited by the need for compatible fluorescent tags and multiplicity of infection tuning to avoid overexpression artifacts.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:49
Plating HeLa-RFP-H2B Cells
3:38
Adenovirus Transduction and Endogenous Protein Knockdown by siRNA Transfection in HeLa-RFP-H2B Cells Using CaPi Precipitates
7:46
Live Cell Imaging of Mitotic Cells and Data Analysis
9:36
Results: Adenofection Effectively Introduces Proteins of Interest without Affecting Mitosis
11:44
Conclusion
