يبلوع الهجرة والسرعة تقاس في لايف الابتدائية الضامة الإنسان المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1

الهدف العام من هذا التحليل هو تحديد سرعة البلعمة في البلاعم المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1 باستخدام طريقة تتبع يدوية بسيطة. تتمثل ميزة هذا البروتوكول في توفير طريقة سهلة لحساب الحركات النسبية لمجموعات الكائنات داخل الخلية التي يمكن أن تتحرك أو مشوهة. توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لحركة البلعمة في البلاعم المصابة ب GFP ولكن يمكن استخدامها للمقصورات الأخرى بين الخلايا في الخلايا ذات العلامات الفلورية.

بعد إصابة البلاعم البشرية المشتقة من الخلايا الوحيدة ومعالجة خلايا الدم التي تربى في الأغنام ، وفقا لبروتوكول النص ، قم بإعداد اختبار البلعمة باستخدام نظام تصوير متحد البؤر ، مثل مجهر القرص الدوار ، المجهز بغرفة تسخين عند 37 درجة مئوية ، بثاني أكسيد الكربون. قبل التجربة ، قم بتشغيل غرفة التسخين لتسخين مرحلة المجهر إلى 37 درجة مئوية. ثم قم بتشغيل المجهر والكمبيوتر ، وقم بتحميل برنامج التصوير.

قم بتحسين إعدادات التصوير ، مثل سرعة المسح ، والتكبير ، والدقة ، وما إلى ذلك ، للحصول على خلية واحدة على الأقل لكل حقل ، وتصوير إطار واحد كل دقيقة بين 60 إلى 120 دقيقة. ضع طبق التصوير على مرحلة المجهر. اضبط التركيز والموقع للعثور على بلاعم واحدة كاملة مصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1 في الميدان.

استخدم إعدادات الإثارة والانبعاث المناسبة بناء على نظام التخيل والمسبار المستخدمين. قم بتضمين قناة مجال ساطع. قم بتحسين مظهره عن طريق ضبط وقت التعرض.

بعد ذلك ، قم بإزالة طبق التصوير وأضف ملليلترا واحدا من خلايا الدم المرباة من الأغنام ، أو تعليق SRBC ، بمعدل سبعة أضعاف عشر من سادس SRBCs لكل مليلتر ، إلى الطبق. قم بالطرد المركزي للطبق عند 500 مرة جم لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة لمزامنة البلعمة ، ثم سجل الوقت في نهاية الطرد المركزي ، وأعد الطبق إلى المسرح. قم بتحسين التركيز وتعيين الجزء العلوي والسفلي من المكدس بمسافة خطوة تبلغ 0.3 ميكرومتر.

ابدأ في الحصول على مكدسات Z لصور GFP و BF في جميع أنحاء سمك الخلية ، واحفظ الفيديو بفاصل زمني بتنسيق الملف الأصلي لنظام التصوير. لإجراء تحرير الفيديو ، في برنامج تحرير الفيديو ، انقر فوق القائمة المنسدلة التطبيقات وفي علامة التبويب مراجعة البيانات متعددة الأبعاد. لفتح الملف ، انقر فوق تحديد الملف الأساسي ، ثم على تحديد الدليل.

في مربع مجموعات البيانات ، حدد الاستحواذ المراد تحليله وانقر فوق عرض. لتمثيل العدوى في إسقاط Z ، في مربع الأطوال الموجية ، حدد الطول الموجي 491 نانومتر وانقر فوق علامة تبويب الإسقاط Z مع جميع الطائرات. بعد ذلك ، لتحليل تسلسل زمني ، في مربع الأطوال الموجية ، حدد الطول الموجي BF واختر المستوى الأمثل على المحور Z للتمييز بين SRBCs الخارجية ، و SRBCs الداخلية ، والنواة.

احفظ مونتاج الفيديو بالنقر فوق علامة التبويب Selection Xs ثم على تحميل الصور. أخيرا ، احفظ الصور المحملة بتنسيق tif. بعد تنزيل المكون الإضافي للتتبع اليدوي Image J ، افتح المكون الإضافي في Image J ، ثم افتح تسلسل الصورة المراد تحليله.

أدخل الإعدادات، مثل الفاصل الزمني، الذي يمثل مقدار الوقت بين الإطارات المجاورة، ومعايرة XY، التي تمثل المسافة لكل بكسل. لبدء التتبع، انقر فوق إضافة مسار، وانقر فوق مركز SRBC في المرة الأولى عندما يتم استيعابه. يظهر الإطار التالي تلقائيا.

للراحة، لرؤية SRBCs على قناة BF، استخدم نافذة السطوع والتباين أثناء التتبع. استمر في النقر فوق مركز SRBC في جميع الإطارات للحصول على مواضع مختلفة خلال الوقت. بين كل تعقب SRBC، انقر فوق إنهاء المسار ثم إضافة مقطع صوتي لبدء مسار جديد.

سيتغير رقم التتبع في العمود الثاني من جدول النتائج. ابدأ في تتبع النواة ليكون لها موضعها في جميع الإطارات بالنقر فوق مركزها كما تم إجراؤه سابقا. احفظ البيانات في جدول بيانات، ثم افتحها في برنامج جداول البيانات، وأنشئ ملف جدول بيانات جديدا.

انقل إلى هذا الملف الجديد الوقت وإحداثيات X و Y ل SRBC والنواة. أخيرا ، استخدم برنامج جداول البيانات لحساب المسافة المقطوعة للبلعمات التي تحتوي على كرات الدم القصيرة باتجاه النواة ، وسرعة البلعمة خلال الدقائق الخمس الأولى بعد استيعاب كرات الدم الحمراء وفقا لبروتوكول النص. يظهر هنا تحليل حركة البلعمة في البلاعم الحية المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية في الوقت الفعلي باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر للقرص الدوار.

تعد إعدادات قناة المجال الساطع أمرا بالغ الأهمية لرؤية النواة ولتمييز الخارج عن SRBCs الداخلية. يرسم هذا الرسم البياني المسافة المقطوعة للبلعمة في HMDMs غير المصابة في الدقائق الخمس الأولى بعد استيعاب SRBC مقابل الوقت. سرعة البلعمة هي ميل منحنى الانحدار الخطي الموضح هنا.

أخيرا ، في هذه الدراسة ، لوحظ أن سرعة البلعمة خلال الدقائق الخمس الأولى بعد الاستيعاب في HMDMs المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية أقل مقارنة ب HMDMs غير المصابة. أظهرت هذه الطرق أن حركة البلعمة إلى مركز الخلية ، وبالتالي نضوج البلعمة إلى البلعمة ، كانت ضعيفة في البلاعم المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية. بعد الحصول عليها ، يمكن معالجة الخلية بشكل أكبر للفحص المجهري الإلكتروني المترابط أو يمكن إصلاح مجموعة الخلايا بأكملها للفحص المجهري المناعي الكلاسيكي والتحليل الإحصائي.

البلعمة حساسة للغاية لدرجة الحرارة ، وبالتالي يجب الحفاظ على درجة الحرارة داخل غرفة التسخين ووسط طبق الثقافة عند 37 درجة مئوية ثابتة طوال العملية. لا تنس أن العمل مع مسببات الأمراض يمكن أن يكون خطيرا ويجب اتخاذ الاحتياطات مثل العمل في غرفة السلامة الحيوية وارتداء معدات الحماية الشخصية وفقا للتشريعات المحلية.