في المختبر تسجيل من مساريقي وارد آخر الأعصاب في ماوس صائمية وقطاعات القولون

الهدف العام من هذه التقنية هو تسجيل نشاط الأعصاب الحشوية الصادرة مختبرياً من حزمة عصبية واحدة في الصائم أو القولون استجابةً للتمددات التدريجية وتطبيق المركبات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال علوم الأعصاب، مثل ما إذا كانت الأعصاب الصادرة التي تغذي الجهاز الهضمي تعاني من فرط التحسس أو نقص التحسس خلال الحالات المرضية المختلفة. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها تسمح بتسجيل تفريغ الأعصاب مختبرياً، كما تتيح قياس نشاط العصب كمياً دون تدخل أو تأثيرات من الجهاز العصبي المركزي.

تمتد آثار هذه التقنية إلى علاج أو تشخيص العديد من متلازمات الألم، مثل متلازمة القولون المتهيج، نظرًا لأن تحسس الأعصاب يلعب دوراً رئيسياً في التسبب في المرض. وبشكل عام، سيواجه الأفراد المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات لأن تشريح الحزم العصبية وتحليل الوحدة الواحدة للإشارة المسجلة يتطلب قدراً كبيراً من التدريب. لبدء هذا الإجراء، ضع الفأر المضحى به في وضعية الاستلقاء الظهري.

قم بإجراء شق طولي في منتصف البطن عبر الجلد وطبقة العضلات البطنية باستخدام المشرط، بحيث يمتد الشق من الناتئ الخنجري وصولاً إلى عظم العانة. بعد ذلك، اشطف تجويف البطن بمحلول Krebs البارد لمنع جفاف الأنسجة داخل البطن. ثم استأصل الصائم بالكامل وبسرعة باستخدام مقص جراحي حاد عن طريق إزالة حوالي 20 centimeters من الأمعاء الدقيقة، بدءاً مباشرة من الثنية الاثني عشرية الصائمية.

احذر من إتلاف الهياكل المحيطة، وحافظ على سلامة مساريق الأمعاء، التي تحتوي على الأوعية الدموية الصائمية والأعصاب الواردة. بعد ذلك، ضع الصائم المستأصل في محلول Krebs بارد على الثلج مع أكسجنتها باستمرار باستخدام Carbigen. ثم، قم بقطع الصائم إلى حلقات يبلغ طولها حوالي ثلاثة سنتيمترات.

حدد موقع الحزمة المساريقية التي تحتوي على الأوعية والعصب الحشوي بالقرب من مركز الحلقة المعنية لتسهيل تثبيت الحلقة في غرفة التسجيل. بعد ذلك، قم بغسل كل قطعة بمحلول Krebs باستخدام قسطرة غير حادة لإزالة محتويات اللمعة والكيموس، حيث تحتوي هذه المواد على إنزيمات هاضمة من شأنها أن تسرع من تلف عينة النسيج في المختبر. بعد ذلك، اختر قطعة لقياس نشاط العصب الوارد وضعها في غرفة التسجيل المبطنة بطبقة من المطاط السيليكوني.

حافظ على درجة حرارة محلول كريبس في غرفة التسجيل عند 34 درجة مئوية. ثم قم بتثبيت قطعة الصائم في حمام الأعضاء، بحيث يكون الطرف الفموي متصلاً بمحرك الحقنة الذي يوفر التدفق اللمعي، والطرف الشرجى متصلاً بمخرج التدفق. قم بشد القطعة قليلاً، مع الحرص على عدم تسليط شد مفرط.

قم بتثبيت الطرفين بإحكام باستخدام رباطات حريرية في منافذ الدخول والخروج. بعد ذلك، قم بتوصيل محرك الحقنة بالطرف الفموي وقم بتروية قطعة الصائم داخل التجويف باستخدام محلول Krebs بمعدل 10 milliliters في الساعة. ثبّت مساريق قطعة الأمعاء المثبتة بشكل مسطح مقابل الطبقة السفلية من مادة السيليكون المرنة.

بعد ذلك، قم بمد المساريقا لتحسين رؤية الحزمة المساريقية. بعد ذلك، قم بإجراء اختبار تمدد تدريجي عن طريق إغلاق منفذ المخرج حتى يصل الضغط داخل التجويف للقطعة المعوية إلى 60 millimeters of mercury للتأكد من عدم تسرب محلول Krebs من القطعة المثبتة. لاحظ ارتفاعاً تدريجياً وسلساً في الضغط داخل التجويف دون أي انقطاعات.

توقع حدوث انقباضات صغيرة في القطعة خلال مرحلة التوسيع الأولية. إذا لزم الأمر، قم بتثبيط النشاط الدودي عن طريق إضافة 1 µmol من مضاد قنوات الكالسيوم من النوع L، nifedipine، إلى محلول Krebs. وباستخدام المجهر الستيريو، ابدأ برفق في إزالة الأنسجة الدهنية من المساريق عن طريق سحبها بلطف باستخدام ملقطين صغيرين، مع الحرص على عدم إتلاف الأوعية والعصب الوارد المدفون في الأنسجة الدهنية.

ابدأ بإزالة الأنسجة الدهنية بعيداً عن الصائم للكشف عن كلا الوعاءين الدمويين في الحزمة المساريقية. حدد العصب الصائم الوارد بين الوعاءين، حيث يظهر كخيط أبيض رفيع مغلف بالأنسجة الدهنية. ثم قم بتشريحه بشكل أقرب باتجاه الصائم عن طريق إزالة الأنسجة الدهنية برفق باستخدام الملاقط.

بعد ذلك، قم بتشريح العصب المساريقي الصائم للجزء المقطوع عن طريق إزالة النسيج الدهني الملتصق بالعصب. اقطع العصب باستخدام مقص أنسجة حاد. وإذا لزم الأمر، قم بإزالة ما تبقى من الدهون والأنسجة الضامة بالإضافة إلى الغمد العصبي عن طريق سحبه بلطف.

في هذا الإجراء، قم بخفض طرف قطب الشفط إلى داخل حمام العضو باستخدام الملاعب الدقيق. بعد ذلك، اسحب برفق كمية من محلول Krebs من حمام العضو، بحيث يغمر طرف القطب في محلول Krebs. تأكد من أن محلول Krebs يغطي القطب السلكي الموجود داخل قطب الشفط.

بعد ذلك، ضع طرف قطب الشفط بجوار خصلة العصب الوارد المقطوعة مباشرة، ثم اسحب خصلة العصب المقطوعة إلى داخل الشعيرية على كامل طولها. حرك طرف القطب باتجاه النسيج الدهني، وقم بشفطه داخل الشعيرية الزجاجية باستخدام المكبس، وبذلك يتم عزل العصب ميكانيكيًا داخل الشعيرية عن محتويات حمام العضو. إن العزل المناسب للشعيرية الزجاجية عن غرفة التسجيل عن طريق شفط بعض الأنسجة الدهنية المحيطة إلى داخل الشعيرية أمر محوري لتقليل ضوضاء الخلفية الزائدة التي من شأنها أن تعيق التحليل النهائي.

للتحقق من تسجيل نشاط العصب الوارد، قم بإحداث زيادة في إطلاق الإشارات الواردة عن طريق التمدد التدريجي، وذلك بإغلاق منفذ المخرج مما يؤدي إلى ارتفاع تدريجي في الضغط داخل القطعة المعوية. لا تنفذ البروتوكول التجريبي المطلوب إلا عندما تؤدي ثلاثة تمددات تدريجية متتالية إلى تفريغ متعدد الوحدات قابل للتكرار. بعد عزل العصب، قم بتثبيت التحضير لمدة 15 دقيقة من أجل الحصول على نشاط عفوي مستقر للعصب الوارد قبل إجراء التجارب الفعلية.

يوضح الشكل هنا تمثيلاً تخطيطياً لوحدات الألياف الواردة المختلفة بناءً على ملف تعريف حساسيتها الميكانيكية. تُظهر الألياف ذات العتبة المنخفضة بشكل أساسي زيادة في النشاط العصبي عند ضغوط التمدد المنخفضة، مما يؤدي إلى نسبة LT تزيد عن 55%. وعلى العكس من ذلك، تظهر الوحدات ذات العتبة العالية زيادة في معدل إطلاق الإشارات فقط عند الضغوط الضارة. أما الألياف ذات النطاق الديناميكي الواسع فتُظهر زيادة تدريجية في النشاط العصبي خلال عملية التمدد بأكملها، بينما لا تستجيب الألياف غير الحساسة ميكانيكياً لزيادة ضغوط التمدد.

يوضح هذا الشكل تفريغ العصب المساريق الصاعد في الفئران من النوع البري أثناء التمدد المتزايد. لاحظ أنه في ملف التمدد ثنائي الطور، يرجع الارتفاع الأولي في تفريغ العصب إلى الألياف ذات العتبة المنخفضة والمدى الديناميكي الواسع، بينما تساهم الألياف ذات العتبة العالية والمدى الديناميكي الواسع في الزيادة الثانية في التفريغ. وبمجرد إتقان العملية، يمكن إجراء عزل العصب الصائم وتسجيل خط الأساس الأولي في أقل من ساعة واحدة إذا تم تنفيذ ذلك بشكل صحيح.

يستلزم الأمر وقتاً إضافياً عند دراسة تأثير المركبات التي يتم إعطاؤها في حمام العضو. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر الحفاظ على نهج معياري دقيق، مثل تحديد الجزء نفسه باستمرار لجميع التجارب. وبالإضافة إلى هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل عزل العقد الجذرية الظهرية مع التصوير الكلسي اللاحق لتقييم محطات الترحيل المشاركة في إمراض العديد من الأمراض في الجهاز العصبي المعدي المعوي.

بعد تطورها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال العلوم العصبية لاستكشاف مسببات عدة متلازمات ألم في أبحاث الجهاز الهضمي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية عزل الأعصاب الصادرة من الصائم في القناة الهضمية للفأر، وتسجيل نشاطها أثناء عمليات التمدد التدريجي.