قياس ل في المختبر التكامل آخر من HIV-1 Preintegration مجمعات

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس نشاط التكامل في المختبر لمجمعات ما قبل الاندماج ، أو PICs ، المعزولة من خلايا SupT1 المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1. ستجيب هذه الطريقة على بعض الأسئلة الرئيسية في بيولوجيا فيروس نقص المناعة البشرية ، وتحديدا كيف تلعب بعض العوامل المضيفة والعوامل الفيروسية ، على سبيل المثال ، القفيصة الفيروسية ، دورا في تكامل الحمض النووي لفيروس نقص المناعة البشرية -1 ، وسيؤدي ذلك إلى مساعدتنا في تصميم أو تحديد أهداف جديدة للعلاج المضاد للفيروسات القهقرية. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها تتطلب كمية صغيرة نسبيا من مجمع ما قبل التكامل ، أو PIC ، للتحضير لقياس نشاط التكامل في المختبر.

يمكن أن تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو تشخيص وعلاج الإيدز HIV-1 ، وذلك لأن الإصدارات السابقة من هذه التقنية كانت حاسمة في اكتشاف مثبطات فيروس نقص المناعة البشرية -1 ، والتي تعد واحدة من الأدوية الرئيسية المضادة لفيروس نقص المناعة البشرية في الاستخدام السريري اليوم ، لذلك لا يمكن استخدام هذه الطريقة فقط لفهم تكامل فيروس نقص المناعة البشرية -1 ، ولكن يمكن تطبيقه أيضا لدراسة الفيروسات القهقرية الأخرى ، مثل RSV و MLV. سيظهر هذا البروتوكول الدكتور موثوكومار بالاسوبرامانيام ، وهو زميل ما بعد الدكتوراه في المختبر. لإصابة SupT1 بفيروس نقص المناعة البشرية -1 ، في مختبر BSL-2 ، حافظ على خلايا SupT1 بين مرة ومرتين 10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر في معهد روزويل بارك التذكاري أو وسيط RPMI المكمل بنسبة 10٪ FBS و Pen-Strep.

بعد توليد عيارات عالية من فيروس نقص المناعة البشرية -1 المعدي وفقا لبروتوكول النص ، قم بتجميع خلايا SupT1 من قوارير الثقافة ، واخلطها جيدا عن طريق سحب العينات ، واستخدم تلطيخ استبعاد التريبان الأزرق في مقياس كثافة الدم لتحديد عدد الخلايا القابلة للحياة. Aliquot ثمانية أضعاف 106 خلايا لكل عدوى فيروسية في أنابيب طرد مركزي مخروطية سعة 50 مليلتر ، ثم طرد الخلايا في دوار دلو متأرجح عند 500 مرة جم و 25 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بدون إزالة وسط زراعة الخلية ، انقل الأنابيب التي تحتوي على خلايا محببة إلى مختبر BSL-3 لمزيد من المعالجة ، ثم قم بشفط الوسط بعناية من الأنبوب دون إزعاج الحبيبات.

بعد ذلك ، أضف 30 مل من لقاح الفيروس المعالج DNase I إلى الخلايا واخلطه عن طريق سحب العينة برفق ، ثم وزع الخليط بالتساوي بين ستة صفيحات لزراعة أنسجة البئر. للاستقليل ، ضع ألواح الثقافة في حاملات الألواح وأجهزة الطرد المركزي في دوار دلو متأرجح عند 480 مرة جم و 25 درجة مئوية لمدة ساعتين ، ثم احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة خمس ساعات. لحصاد الخلايا المصابة وتحللها ، قم بتجميع الخلايا المقابلة لكل عدوى في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 ملليلترا.

قم بالطرد المركزي للخلايا عند 300 مرة جم و 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، ثم قم بشفط المادة الطافية أو ماصتها بعناية. لإزالة أي جزيئات فيروس متبقية ، اغسل كل حبيبات بإضافة ملليلترين من المخزن المؤقت K ناقص وقم بتدوير العينة مرة أخرى ، ثم دون إزعاج الحبيبات ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية عن طريق الشفط أو باستخدام ماصة قبل تكرار الغسيل مرة أخرى. بعد إزالة أي مخزن مؤقت متبقي بعناية باستخدام ماصة دقيقة، استخدم المخزن المؤقت للتحلل المثلج K plus plus لإعادة تعليق كل حبيبات برفق ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة ملليلتر.

لتحضير مجمعات التكامل المسبق للسيتوبلازم، أو PICs، قم بهز العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق، ثم ضع الأنابيب في دوار مبرد مسبقا إلى أربع درجات مئوية، وجهاز طرد مركزي عند 1،500 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة أربع دقائق. دون إزعاج الحبيبات ، انقل المادة الطافية بعناية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد وتدور عند 16 ، 000 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة. انقل المادة الطافية بعناية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد ، ثم أضف RNase A إلى تركيز نهائي يبلغ 20 ميكروغراما لكل مليلتر ، واحتضن المحتويات في درجة حرارة الغرفة دون التأرجح لمدة 30 دقيقة.

يضاف السكروز إلى التركيز النهائي البالغ 7٪ ويخلط جيدا عن طريق سحب العينة برفق ، ثم قم بإعداد حصص من PICs في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. قم بتجميد الفلاش في النيتروجين السائل وضعه في فريزر سالب 80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل. لتحضير الحمض النووي المستهدف المستخدم في التكامل في المختبر أو اختبار IVI ، قم بتجميع مخاليط تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم منطقة 2.0 كيلو قاعدة من الحمض النووي البلازميد phiX174 باستخدام الاشعال المصنوعة خصيصا phiX174-Forward و phiX174-Reverse ، وإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البرنامج وفقا لبروتوكول النص.

بعد تنقية الجل واقتباس العينة ، أضف 600 نانوجرام من الحمض النووي المستهدف إلى 200 ميكرولتر من PICs. تخلط جيدا وتحتضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. أوقف تفاعل IVI عن طريق إضافة SDS و EDTA و proteinase K ، ثم امزج محتويات التفاعل جيدا واحتضن عند 56 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

في اليوم التالي ، لتنقية الحمض النووي الكلي من تفاعل IVI ، أضف حجما متساويا من الفينول إلى العينة منزوعة البروتين. تخلط بقوة عن طريق الدوامة والطرد المركزي لمدة دقيقتين. قم بإزالة المرحلة المائية العلوية بعناية وانقلها إلى أنبوب جديد قبل تكرار استخراج الفينول ، ثم أضف حجما متساويا من واحد إلى واحد من كلوروفورم الفينول.

امزج العينة عن طريق الدوامة والطرد المركزي للأنبوب لمدة دقيقتين ، ثم انقل المرحلة المائية العلوية إلى أنبوب جديد. بعد الاستخراج باستخدام الكلوروفورم وفقا لبروتوكول النص ، قم بترسيب الحمض النووي من المرحلة المائية عن طريق إضافة 0.1 ميكروغرام لكل ميكرولتر من الجليكوجين و 0.3 مولي أسيتات الصوديوم و 2.5 حجم من المثلج البارد 100٪ الإيثانول. ضع الأنبوب عند سالب 80 درجة مئوية طوال الليل.

في اليوم التالي ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 16 ، 000 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة ، ثم قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج الحبيبات. لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل لقياس نشاط الموافقة المسبقة عن علم ، ابدأ بالجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي باستخدام بادئات تستهدف LTR الفيروسي والحمض النووي phiX174 لتضخيم تقاطعات الحمض النووي المتكامل لفيروس نقص المناعة البشرية -1. قم بتجميع المزيج الرئيسي مطروحا منه الحمض النووي للقالب كما هو موضح هنا ، ثم قم بتوزيع 45 ميكرولتر في أنابيب PCR منفصلة وأضف خمسة ميكرولترات من قالب الحمض النووي أو الماء الخالي من النوكلياز كعنصر تحكم.

قم بتشغيل التفاعل في جهاز تدوير حراري باستخدام البرنامج الموضح في بروتوكول النص ، ثم قم بإجراء جولة ثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي وتحليل البيانات وفقا لبروتوكول النص. في اختبار IVI هذا ، تم تلقيح SupT1 باستخدام DNAse I الذي عالج HIV-1 ، وغياب أو وجود مثبط إنتگراز HIV-1 ، Raltegravir. بعد الحضانة ، تم عزل PICs وتم تحليل الحمض النووي المنقى لتكامل الحمض النووي الفيروسي.

كما هو موضح هنا ، فإن بلدان جزر المحيط الهادئ لفيروس نقص المناعة البشرية -1 تدمج بقوة الحمض النووي الفيروسي المرتبط في الحمض النووي المستهدف وتم تقليل كفاءة IVI ل PICs بشكل كبير في التفاعلات المكملة ب Raltegravir ، مما ينطوي بشدة على نشاط التكامل المقاس في هذا الاختبار مع تكامل فيروس نقص المناعة البشرية -1. لم تظهر تفاعلات التحكم أي نشاط تكامل. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التحكم الذي استبعد Taq polymerase في الجولة الأولى من PCR لم يضخم منتجات التكامل.

والجدير بالذكر أن البيانات من التحكم في PICs وحدها أشارت إلى أن استراتيجية qPCR المتداخلة تقيس على وجه التحديد الحمض النووي الفيروسي المتكامل ، ولكن ليس الحمض النووي الفيروسي المرتبط ب PIC. وتبين هذه البيانات مجتمعة نشاط التكامل المرتبط بالموافقة المسبقة عن علم. بمجرد إتقان ، يمكن إكمال فحوصات تحضير الفيروس ومقايسات تفاعل البوليميراز المتسلسل لقياس نشاط الموافقة المسبقة عن علم في غضون أسبوع.

يمكن إجراء إصابة خلايا SupT1 وعزل PICs من الخلايا المصابة في يوم واحد. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل بلدان جزر المحيط الهادئ لفيروس نقص المناعة البشرية -1 وقياس نشاط التكامل في المختبر. لا تنس أن العمل مع عيارات عالية من فيروس نقص المناعة البشرية -1 المعدي يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات المناسبة ، بما في ذلك الملابس الواقية مثل المآزر والعباءات والقفازات المزدوجة والنظارات الواقية ، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.