عزل، التمايز، والكمي للالإنسان الأجسام المضادة إفراز خلايا B من الدم: ELISPOT باعتبارها قراءات الوظيفية للالخلطية الحصانة

الهدف العام من منهجية ELISpot هذه هو السماح بالقياس الكمي للخلايا البائية التي تفرز الأجسام المضادة البشرية من الدم. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في المجال الطبي الحيوي حول مناعة الخلايا البائية وأبحاث اللقاحات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح باكتشاف وقياس الخلايا البائية التي تفرز الأجسام المضادة على مستوى الخلية الواحدة.

سيوضح الإجراء Tsung-Chih Tseng ، طالب دراسات عليا من مختبري. مباشرة بعد الحصول على عينة دم 10 مل من الوريد المرفقي المتوسط في أنبوب سعة 15 مل يحتوي على EDTA المكمل بالبوتاسيوم ، اقلب الأنبوب عدة مرات لمنع تكون الجلطة. ثم أضف 35 مل من المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء المعقمة إلى الخلايا لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

عندما يمكن ملاحظة الضوء من خلال الأنبوب ، قم بالطرد المركزي للدم وتأكد من وجود حبيبات بيضاء. قم بإزالة المخزن المؤقت للتحلل المتبقي مع 10 مل من PBS المعقم وأعد تعليق الحبيبات في 10 مل من وسط RPMI 1640. ضع الخلايا في طبق استزراع 10 سم لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية وخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون.

ثم قم بتدوير طبق الثقافة برفق عدة مرات وانقل الخلايا العائمة إلى أنبوب مخروطي بلاستيكي سعة 15 مل. بعد غسلتين عن طريق الطرد المركزي ، أعد تعليق الحبيبات عند خمسة إلى 10 أضعاف عشر الخلايا الست لكل تركيز مل في 200 ميكرو لتر من المخزن المؤقت PBS البارد وأضف 5 لترات صغيرة من كوكتيل الأجسام المضادة للإنسان المضاد للإنسان المضاد للبيوتينيل المخصص لخلايا الدم لكل مرة واحدة في عشر الخلايا السادسة. بعد حضانة لمدة 30 دقيقة على الجليد ، اغسل الخلايا في حجم زائد بمقدار 10 أضعاف من PBS المعقم وأعد تعليق الحبيبات في خمسة لترات صغيرة من الخرز الدقيق المترافق بالستربتافيدين لكل مرة واحدة في عشر الخلايا الست لمدة 30 دقيقة حضانة على الجليد.

في نهاية الحضانة ، أضف ملتين من المخزن المؤقت PBS إلى الخلايا وضع الأنبوب على حامل مغناطيسي لمدة ثماني دقائق في درجة حرارة الغرفة. عندما تلتصق الخرزات الدقيقة بجدار الأنبوب ، انقل المادة الطافية بعناية إلى أنبوب مخروطي جديد وأضف 2 مل أخرى من المخزن المؤقت PBS إلى الخلايا. بعد المجموعة الثانية من المواد الطافية ، اجمع الخلايا المجمعة عن طريق الطرد المركزي وانقل الخلايا إلى أنبوب بوليسترين بسعة خمسة مل ومخزن مؤقت جديد ل PBS بمقدار واحد في عشر الخلايا السبع لكل تركيز مل.

بعد تشكيل الحجب غير المحدد ، أضف ميكروغراما واحدا من كل جسم مضاد للاختيار لكل مرة واحدة في عشر الخلايا الست إلى الأنبوب مع خلط لطيف لمدة 30 دقيقة على الجليد. خلال الدقائق الخمس الأخيرة من الحضانة ، أضف خمسة لترات صغيرة من 7-AAD إلى الخلايا. ثم أضف مللي لترين من PBS الطازج إلى الخلايا والدوامة قبل الطرد المركزي.

أعد تعليق الحبيبات في مخزن مؤقت للفرز الطازج عند واحد إلى خمسة أضعاف عشر الخلايا السبع لكل تركيز ملي لتر وتصفية الخلايا من خلال مصفاة خلية 40 ميكرون في أنبوب بوليسترين جديد سعة خمسة مللي لتر. ثم قم بفرز الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي إلى ثلاثة أنابيب سعة 15 مل تحتوي على 5 مل من وسط RPI الطازج لجمع الخلايا البائية الساذجة وخلايا الذاكرة B وخلايا البلازما البلازما. عندما يتم حصاد جميع الخلايا ، قم بزرع المجموعات الفرعية في آبار فردية من لوحة زراعة خلايا 12 بئر عند واحد إلى عشرة أضعاف عشر الخلايا الخامسة لكل تركيز مللي لتر في وسط RPMI الطازج.

بعد ذلك ، قم بتنشيط الخلايا البائية بخمسة ميكروغرام من CPG ODN 2006 لكل مرة في عشر الخلايا السادسة لكل مليلتر لكل بئر في حاضنة زراعة الخلية لمدة خمسة أيام. في نهاية التنشيط ، أضف 30 لترا صغيرا من الإيثانول بنسبة 35٪ والماء المقطر إلى كل بئر من ألواح ELISpot لمدة 30 ثانية. ثم استبدل الإيثانول في كل بئر ب 150 لترا صغيرا من الماء المقطر المزدوج المعقم واحتضان الألواح في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق لإزالة الإيثانول المتبقي.

قم بإجراء غسيل PBS متبوعا بإضافة 50 لترا صغيرا من جزء FAB2 متعدد النسيلة من IG المضاد للإنسان إلى كل بئر. اغسل الأطباق مرتين باستخدام PBS كما هو موضح للتو. قم بسد الربط غير المحدد في كل بئر ب 200 لتر ميكرو من PBS الطازج مع BSA لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.

بعد سلسلة غسيل PBS أخرى ، احتضن الآبار في 100 لتر ميكرو من متوسط RPMI 1640 الطازج عند 37 درجة مئوية. ثم استبدل الوسط الموجود في كل بئر ELISpot بالعدد المناسب من الخلايا البائية المنشطة. ارفع الحجم النهائي لكل بئر إلى 150 ميكرو لترا مع وسيط RPMI طازج ثم أعد لوحة ELISpot إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة ثماني إلى 14 ساعة.

في نهاية فترة الحضانة ، تخلص من الوسط واغسل الآبار ب 200 لتر ميكرو من PBS بالإضافة إلى tween20 لمدة خمس وثلاث دقائق من الغسل. بعد الغسيل الأخير ، أضف الأجسام المضادة المناسبة للكشف إلى الآبار المقابلة لها واحتضن الألواح لمدة ساعتين في الظلام. بعد سلسلة غسيل PBS أخرى ، أضف 50 لترا صغيرا من ركيزة BCIPMBT إلى كل بئر لمدة خمس إلى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

عندما تظهر بقع أرجوانية ، أوقف التفاعل باستخدام 100 لتر ميكرو من الماء المقطر المزدوج لكل بئر واشطف اللوحة بماء الصنبور الجاري. ثم جفف غشاء ELISpot في الهواء محميا من الضوء. في عينة PBMC من المتبرع ، بعد تحلل خلايا الدم الحمراء واستنفاد الخلايا الملتصقة ، كانت حوالي 10 في المائة من الخلايا الليمفاوية خلايا بائية إيجابية CD19.

في حجرة الخلايا البائية ، كان حوالي 50 في المائة من الخلايا عبارة عن خلايا بائية ساذجة سلبية CD27 و 50 في المائة كانت CD27 تعبر عن خلايا الذاكرة البائية. علاج CPG للخلايا البائية البشرية المنقاة و CD19 + CD27 + لمدة خمسة أيام كما هو موضح للتو ينتج عادة ما يؤدي إلى توليد 50 إلى 200 IgM و 10 إلى 50 IgG خلايا تفرز أجسام مضادة من مرة واحدة في عشرة إلى رابع الخلايا البائية المنشطة. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال تقنية ELISpot هذه في ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

قبل البدء في هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر ترميز المكان بإعادة عوامل التقاط مناسبة للكشف عن الخلايا التي تفرز الأجسام المضادة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم اللقاحات لاستكشاف فعالية اللقاح في التجارب واسعة النطاق والمتابعة الطولية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنقية الخلايا البائية البشرية من الدم.

افصل الخلايا البائية الساذجة والذاكرة لتمايزها وقم بإجراء مقال ELISpot لتأهيل الخلايا التي تفرز الأجسام المضادة. لا تنس أن العمل بدم الإنسان يمكن أن يكون خطيرا وأنه يجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.