العرض الداخلية غشاء البكتيريا لفحص مكتبة من الأجسام المضادة شظايا

الهدف العام من هذا الإجراء هو تسخير مراقبة جودة الطي لمسار نقل الأرجينين المزدوج لهندسة ربط شظايا الأجسام المضادة والطي داخل الخلايا في خطوة واحدة والتي سيكون لها تطبيقات في هندسة الأجسام المضادة للعمل داخل الخلايا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في التغلب على التحديات الرئيسية في مجال هندسة الأجسام المضادة مثل التغلب على صعوبة هندسة الأجسام المضادة للطي والعمل بشكل صحيح في البيئة السيتوبلازمية المختزلة. يتم عرض الأجسام المضادة التي تطوى جيدا في السيتوبلازم وفحصها للربط.

توفير ميزة على عرض الخميرة والعاثيات التي تعتمد على مسارات إفرازية للعرض. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاجنا للأمراض التنكسية العصبية والسرطان والالتهابات الفيروسية لأن هذه الأمراض تنطوي على التسبب في المرض داخل الخلايا التي يمكن أن تستهدفها الأجسام المضادة. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن فهم كيفية توليد البلاستيدات الكروية والعمل معها يمثل تحديا.

بعد دمج مكتبة scFv في تسلسل إشارة ssTorA وزراعتها عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز لمدة ثلاث ساعات ، اسمح بالتعبير عن مكتبة scFv عند 20 درجة مئوية و 225 دورة في الدقيقة طوال الليل لمدة 15 إلى 22 ساعة. بعد الحضانة ، استخدم مقياس الطيف الضوئي لقياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر. ثم جهاز الطرد المركزي الحجم المحسوب للثقافة المستحثة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر عند 12 ، 000 مرة جم ودرجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

قم بإزالة المادة الطافية واستخدم 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتجزئة المثلجة أو fB لإعادة تعليق الكريات. ثم الطرد المركزي للعينات عند 12 ، 000 مرة جم ودرجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. بعد إزالة المادة الطافية ، استخدم 350 ميكرولتر من البصيفات الكريمة الباردة المثلجة مع 3.5 ميكرولتر من 10 ملليغرام لكل مليلتر من الليزوزيم لإعادة تعليق الكريات.

بعد ذلك ، أثناء دوامة الأنابيب ببطء ، أضف 700 ميكرولتر من 1 مللي مولار EDTA ثم احتضان الأنابيب على دوار أنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة لخلط العينات. قم بإزالة الأنابيب من الدوار. أضف 50 ميكرولترا من نقطة الجليد الباردة خمسة مولية MgCl2 إلى كل أنبوب واحتضانها على الجليد لمدة 10 دقائق.

ثم الطرد المركزي للعينات عند 11 ، 000 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. الآن ، باستخدام ماصة دقيقة وطرف مليلتر واحد ، اسحب جزءا من الحبيبات ببطء. بعد ذلك ، أثناء الإمساك بالأنبوب ، بزاوية مع الفتحة مباشرة فوق أنبوب جديد سعة 1.5 مليلتر ، ارفع طرف الماصة ببطء من المادة الطافية وحرك الحبيبات في الأنبوب الجديد.

بعد إزالة المادة الطافية الزائدة ، استخدم ملليلترا واحدا من PBS المثلج لإعادة تعليق البلاستيدات الكروية. يجب إعادة تعليق البلاستيدات الكروية تماما قبل التحريك لأن scFvs غير الملزمة الموجودة في الركام ستؤدي إلى إيجابيات خاطئة من التحريك. بعد إيوتينيل المستضد المستهدف وفقا لبروتوكول النص ، أعد تعليق الخرز المغناطيسي المطلي بالستربتافيدين في قارورتها الأصلية.

ثم نقل سبعة إلى 10 مرات 10 إلى 9 حبات إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. ضع أنبوب الخرز على الرف المغناطيسي لمدة دقيقتين لجمع الخرز على جانب الأنبوب والماصة لإزالة المادة الطافية بعناية. قم بإزالة الأنبوب من المغناطيس واستخدم PBS لإعادة تعليق الخرزات دون توليد فقاعات.

ثم أعد الأنبوب إلى المغناطيس وقم بإزالة المخزن المؤقت قبل غسل الخرزات مرتين أخريين باستخدام PBS. أضف ملليلترا واحدا من المحللة التي تحتوي على مستضد البيوتينيل إلى الخرزات واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة أثناء الدوران برفق. بعد الحضانة ، استخدم PBS مع 1٪ BSA لغسل الخرزات خمس مرات.

ثم استخدم PBS مع 1٪ BSA لإعادة تعليق الخرز. لفحص مكتبة scFv ، ابدأ بإضافة أربعة أضعاف 10 إلى البلاستيدات الكروية التاسعة وثمانية أضعاف 10 إلى الخرز الثامن إلى أنبوب معقم سعة 15 ملليلترا. أضف واحدا × PBS مع 1٪ BSA ليصل الحجم الإجمالي إلى أربعة ملليلترات.

ثم قم بتقسيم المحلول إلى أربعة أنابيب سعة 1.5 ملليلتر سعة كل منها واحتضان التفاعلات عند أربع درجات مئوية عن طريق الدوران برفق لمدة خمس ساعات. لتحضير البلاستيدات الكروية المرتبطة بالخرز لتفاعل البوليميراز المتسلسل ، ضع أنابيب تفاعل التحريك على المغناطيس لمدة ثلاث دقائق. قم بإزالة المادة الطافية واغسل الخرزات ب one x PBS مع 1٪ BSA أربع مرات كما كان من قبل.

ثم استخدم 25 ميكرولترا من ddH20 لكل أنبوب لإعادة تعليق الخرز. كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بإجراء PCR كامل لتضخيم الجينات ل scFvs المرتبطة بالخرز ثم إعادة تدوير البلازميد من منتج PCR. قم بتحويل التفاعل بأكمله إلى خلايا معادلة MC4100 وفقا لبروتوكول النص.

لتحديد المستنسخة باستخدام ELISA ، قم بإذابة أنبوب واحد من المكتبة الفرعية واللوحة على ألواح أجار LB. أضف 200 ميكرولتر من LB مع 20 ميكروغرام لكل مليلتر من الكلورامفينيكول في كل بئر من لوحة ثقافة 96 بئر مستديرة. باستخدام طرف الماصة ، اختر مستعمرة فردية من لوحة الأجار.

ثم ضع الطرف في البئر الأول من طبق البئر 96 وحركه برفق حتى يتم تلقيحه. استمر في تلقيح مستعمرة واحدة في كل بئر. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 20 إلى 24 ساعة على شاكر ميكروبليت.

بعد تحضير محلول طلاء مستضد مستهدف وفقا لبروتوكول النص ، أضف 50 ميكرولترا من المحلول إلى كل بئر من لوحة ELISA المصنوعة من البوليسترين الشفاف عالي الارتباط 96 بئر. احتضن الصفائح عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. بعد ذلك ، قم بتكرار المستعمرات من 96 لوحة زراعة بئر على ألواح أجار وفقا لبروتوكول النص.

بعد ذلك ، قم بإفراغ محلول الطلاء من ألواح ELISA وأضف 100 ميكرولتر من محلول الحجب المحضر وفقا لبروتوكول النص لكل بئر. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين على الأقل أو عند أربع درجات مئوية طوال الليل. أضف 20 ميكرولترا من منظف تحلل الخلايا المركز إلى كل بئر من لوحة الثقافة القاعية المستديرة واحتضان لوحة الثقافة على شاكر صفيحة دقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 إلى 20 دقيقة.

أفرغ محلول الحظر من ألواح ELISA واغسل الآبار أربع مرات باستخدام 200 ميكرولتر من محلول الغسيل المحضر وفقا لبروتوكول النص. بعد إزالة الغسيل النهائي ، انقل 50 ميكرولترا من كل بئر من لوحة تحلل الخلية إلى البئر المقابل للوحة ELISA. احتضان الأطباق في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة إلى ساعتين.

تابع تفريغ العينات من لوحة ELISA واغسل الآبار أربع مرات. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول الأجسام المضادة للكشف عن scFvs وفقا لبروتوكول النص. أضف 50 ميكرولترا من الجسم المضاد إلى كل بئر واحتضنه لمدة ساعة إلى ساعتين في درجة حرارة الغرفة.

اغسل ألواح ELISA أربع مرات باستخدام محلول غسيل قبل إضافة 200 ميكرولتر لكل بئر من ركيزة HRP المحضرة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. احتضن الأطباق في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 إلى 60 دقيقة. لإخماد التفاعل ، أضف 50 ميكرولترا من ثلاثة مولات H2SO4 إلى كل بئر وماصة برفق لخلط المحلول.

أخيرا ، قم بقياس الامتصاص باستخدام قراءة لوحة عند 492 نانومتر. في هذه التجربة ، الأجسام المضادة scFv scFv13 و scFv13. تم دمج R4 إما في تسلسل ssTorA الأصلي أو ssTorA المعدل الذي لم يتم التعرف عليه بواسطة مسار نقل الأرجينين المزدوج ، والذي يسمى أيضا مسار Tat.ScFv.

يتم طي R4 جيدا ويتم التعبير عنه على الغشاء الداخلي عند غرسه في ssTorA الأصلي. لا يتم طي ScFv13 جيدا ولا يتم عرضه على الغشاء الداخلي بغض النظر عن ببتيد إشارة Tat الذي يتم دمجه إليه. توضح هذه النتائج أن البروتينات التي تحتوي على ببتيد إشارة Tat ويتم طيها بشكل صحيح في السيتوبلازم يتم عرضها فقط على الغشاء الداخلي ، مما يسمح لمسار Tat بالعمل كشاشة للطي داخل الخلايا.

في هذه التجربة ، تم انتقاد مكتبة تفاعل البوليميراز المتسلسل المعرضة للخطأ القائمة على scFv13 ، والتي لديها مستوى منخفض من تقارب الارتباط ببيتا جالاكتوزيداز ضد بيتا غال. تم عزل ScFv 1-4 وأظهر تقاربا أعلى للارتباط ببيتا غال من scFv13 بالإضافة إلى مستوى أعلى من الذوبان السيتوبلازمي. باستخدام scFv 1-4 كمنافس ضد الجيل الثاني من مكتبة scFv 1-4 ، تم عزل scFv 2-1 و 2-3 وأظهروا تقاربات ارتباط أعلى لبيتا غال من scFv13 1-4 ، مما يسلط الضوء على الهندسة المتزامنة للذوبان وربط المستضد.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل ELISA باستخدام المحللة المنقى من أجل التحقق من خصوصية المستضد وتحديد تقارب الارتباط للنسخ المعزولة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تفهم كيفية فحص الجسم المضاد للعمل للارتباط بمستضد ذي أهمية باستخدام مسار Tat لعرض تلك المكتبة وتحريك الخرزة المغناطيسية لإثراء وعزل روابط المستضد. لا تنس أن العمل مع حامض الكبريتيك يمكن أن يكون خطيرا للغاية وأن ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة ضروري.