Name: تبوغ الفعال لل خميرة الخباز في تنسيق Multiwell 96 (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: تعلم تبوغ خميرة الخباز بكفاءة في صيغة 96 بئرًا لتمكين الفحص عالي الإنتاجية. تعالج هذه الطريقة تحديات التهوية لتحسين كفاءة التبوغ في دراسات الجينوم الوظيفي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل من خلال منحة جوزيف هيلي من جامعة ماساتشوستس في بوسطن (LSH) وR15 GM86805 من المعاهد الوطنية للصحة (LSH). ويدعم SMP جزئيا على زمالة سانوفي-جنزايم في جامعة ماساتشوستس في بوسطن.

1. الاستعداد للتبوغ ملاحظة: وسائل الإعلام وصفها في هذا البروتوكول تتم باستخدام وصفات وطرق معيارية 13،17 يعطي الجدول 1 صياغة ل1 لتر من وسائل الإعلام المختلفة المستخدمة في هذا البروتوكول. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" height="180" width="469" style=";text-align:right;direction:rtl"><colgroup><col /><col /><col span="3" /><col /><col span="2" /></colgroup><tbody><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"></td><td style="width: 55px;"> Bacto ببتون </td><td style="width: 50px;"> خلاصة الخميرة </td><td style="width: 50px;"> Bacto آجار </td><td style="width: 60px;"> سكر العنب </td><td style="width: 70px;"> البوتاسيوم خلات </td><td style="width: 60px;"> الغليسيرول </td><td style="width: 60px;"> ده 2 O </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> لوحات YPG </td><td> 20 ز </td><td> 10 ز </td><td> 20 ز </td><td> - </td><td> - </td><td> 30 مل </td><td> 970 مل </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> لوحات YPD </td><td> 20 ز </td><td> 10 ز </td><td> 20 ز </td><td> 20 ز </td><td> - </td><td> - </td><td> 1000 مل </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> YPD السائل </td><td> 20 ز </td><td> 10 ز </td><td> - </td><td> 20 ز </td><td> - </td><td> - </td><td> 1000 مل </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> YPA السائل </td><td> 20 ز </td><td> 10 ز </td><td> - </td><td> - </td><td> 20 ز </td><td> - </td><td> 1000 مل </td></tr><tr height="15"><td style="height: 20px; width: 80px;"> وسائل الإعلام تبوغ </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 ز </td><td> - </td><td> 1000 مل </td></tr></tbody></table> يتم إعطاء صيغ وسائل الإعلام مبالغ ل1 لتر من وسائل الإعلام: الجدول 1. تفاصيل حول وسائل الإعلامالمكونات يمكن العثور عليها في جدول المواد. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا جميع خلايا Sporulating سوف يكون التركيب الوراثي نفسه، اتبع هذا الإجراء: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الخميرة سلالة لاستخدامها في الصعود إلى (YPGlycerol) لوحة YPG. تنمو الخميرة ل12-16 ساعة عند 30 درجة مئوية. الأهم من ذلك، تستعد خلايا SK1 أيضا إلى sporulate، لذلك سلالات SK1 لا ينبغي أن تترك وقتا طويلا على لوحات YPG، أو أنها قد sporulate على لوحة. ملاحظة: يفضل سلالة إذابة حديثا نمت على YPG، والاستفادة من الجلسرين كمصدر الكربون يتطلب الفسفرة التأكسدية، وبالتالي يختار لالخلايا التي تحتوي الحمض النووي وظيفية. خلايا SK1 لديهم ميل لفقدان الحمض النووي وظيفية وتصبح خادمات. وهناك حاجة الحمض النووي وظيفية للتبوغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخميرة متتالية من لوحة YPG الصعود إلى (YPDextrose) لوحة YPD لالمستعمرات واحد. تنمو الخميرة على لوحة YPD 24-28 ساعة عند 30 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حوالي 36-48 ساعة من النمو على YPD وسائل الاعلام الصلبة، وبدء 25 مل ثقافة YPD باستخدام مستعمرة واحدةمن لوحة YPD. تنمو هذه الثقافة حتى الخلايا حول OD 600 = 4،0-7،0. تنفيذ هذه الخطوة عند 30 درجة مئوية خلال الليل في حاضنة تهتز، تهتز في 220 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من ثقافة YPD، استخدم مبلغ مناسب من الخلايا لبدء 1000 مل من YPA (YPAcetate) الثقافة التي هي OD 600 = 0.1 لكل حاجة 96 لوحة جيدا في القسم 2. تنمو الخميرة في 30 ° C هز حاضنة (اهتزاز في 220 دورة في الدقيقة) حتى ثقافة OD 600 ما بين 1،3-1،5. ملاحظة: تطعيم 100 مل من ثقافة YPA لكل لوحة multiwell 96 ليتم عرضه في القسم 2. على سبيل المثال، إذا فحص أربعة 96 لوحات multiwell، ستكون هناك حاجة إلى 400 مل من ثقافة YPA. بدءا من حجم إضافي 10٪ في الثقافة YPA غير الضرورية لحماية ضد فقدان حجم التبخر. عادة، سوف يستغرق ما بين 12-16 ساعة للخلايا للوصول الى OD المناسب 600. مقدار الوقت قد تختلف اعتمادا على التركيب الوراثي لسلالة الخميرة. YPA هو وسائل الإعلام presporulation. Pregrowthفي خلات يساعد لحث على التعبير عن الجينات (مثل IME1) اللازمة لكفاءة ومتزامن تبوغ 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في 1800 x ج في أعلى الجدول أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق لتكوير الخلايا المزروعة في YPA. غسل الخلايا 1X مع 0.5 حجم الماء منزوع الأيونات تعقيمها العقيمة. تدور مرة أخرى، وتجاهل يغسل. Resuspend الخلايا في وسائل الإعلام حجم تبوغ 1X. الاستمرار في القسم 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حالة استخدام الخلايا للتبوغ التي هي من المورثات المختلفة، (أي، تحولت مع البلازميدات مختلفة أو تحتوي على الطفرات المختلفة، التي تم الحصول عليها عادة وتخزينها على شكل أسهم المجمدة)، وخلايا مجموعة من التراكيب المختلفة في شكل multiwell 96. ثم اتبع هذا الإجراء: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام معقم عبة Frogger 96 الشق لنقل الخلايا من الأسهم المجمدة المذابة في 96 لوحة multiwell (ق) على YPG وسائل الاعلام الصلبة. تنمو الخميرة بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام معقم عبة Frogger 96 الشق، ونقل الخلايا من YPG وسائل الاعلام الصلبة على YPD وسائل الاعلام الصلبة أو انتقائيةوسائل الاعلام الصلبة (أي الحد الأدنى من وسائل الإعلام الاصطناعية تفتقر الأحماض الأمينية، وإذا احتوت الخلايا البلازميدات التي تتطلب الاختيار). تنمو الخميرة عند 30 درجة مئوية حتى يتم تشكيل مستعمرات لكل سلالة، عادة 1 يوم YPD و2 أيام إذا وسائل الإعلام الانتقائي أمر ضروري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة 1.2 مل من YPD السائل وسائل الإعلام أو وسائل الإعلام السائلة انتقائية في كل بئر من 96 العميقة 2 مل لوحة multiwell. نقل الخلايا من وسائل الاعلام الصلبة إلى السائلة وسائل الإعلام باستخدام عبة Frogger، وتغطي بغطاء بلاستيكي في مكانها بواسطة الشريط، وتنمو بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية شاكر، والهز في 220 دورة في الدقيقة. ملاحظة: للحد من التلوث، وتغطية لوحات باستخدام الأغطية البلاستيكية من لوحة بتري مستطيلة. عقد الأغطية في مكان باستخدام قطعة من الشريط، لذلك يقتصر ذلك دوران الهواء الحد الأدنى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحات أجهزة الطرد المركزي في 1800 x ج لمدة 5 دقائق، وذلك باستخدام دلو الطرد المركزي يتأرجح مع محولات لاستيعاب 96 لوحات جيدة. تخلصي من وسائل الإعلام من الخلايا. إضافة 500 ميكرولتر YPA إلى كل بئر و resuspend الخلايا مكعبات في YPA. غطاء، يغطيمع غطاء من البلاستيك الذي عقد في مكان من الشريط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخلايا لمدة 15 ساعة على 30 درجة مئوية في حاضنة تهتز، تهتز في 220 دورة في الدقيقة. الاستمرار في القسم 2. </li></ol></li></ol> 2. خلايا Sporulating في تنسيق Multiwell 96 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة أي واحد 3 مم معقمة حبة الزجاج الصلبة أو معقمة 5 مم × 2 مم شريط مغناطيسي في كل بئر من 96 لوحة جيدا مع 1.3 مل الآبار. (انظر ممثل النتائج أدناه للحصول على مناقشة حول ما إذا كان استخدام حبة أو بقضيب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وإذا كان كل الخلايا ليتم عرضه من نفس النمط الجيني، انتقل إلى 2.2.1. إذا كانت الخلايا ليتم عرضه هي من المورثات مختلفة، انتقل إلى 2.2.2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخذ خلايا من الخطوة 1.1.5 وقسامة 500 ميكرولتر من الخلايا بالإضافة إلى وسائل الإعلام في كل بئر من لوحة multiwell 96. تغطية مع غطاء من البلاستيك الذي عقد في مكان من الشريط. المضي قدما إلى 2.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا تدور التي هي في YPA من 1.2.4 في 1800 x ج لمدة 5 دقائق، وذلك باستخدام دلو الطرد المركزي يتأرجح مع محولات لاستيعاب 96 لوحات جيدة. صب لوسائل الإعلام و من الخلايا. إضافة 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام تبوغ إلى كل بئر و resuspend الخلايا مكعبات في وسائل الإعلام تبوغ. تغطية مع غطاء من البلاستيك الذي عقد في مكان من الشريط. المضي قدما إلى 2.3. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حالة استخدام حبة الزجاج، وعينات من مكان في حاضنة تهتز عند 30 درجة مئوية ويهز في 220 دورة في الدقيقة لتبوغ. في حالة استخدام شريط مغناطيسي، وعينات من مكان على طبق من ضجة داخل 30 درجة مئوية الحاضنة للتبوغ. ملاحظة: سرعة ضجة الدقيق للقضبان تحريك مغناطيسي ليست مهمة جدا، ما دامت جميع الحانات تتحرك بنشاط وتهوية الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمراقبة التقدم من خلال تبوغ، سحب عينات من ثقافة sporulating عن التصور، إضافة 6 ميكرولتر من الخلايا من الثقافات sporulating إلى 24 ميكرولتر من وسائل الإعلام تبوغ في لوحة 96 ساترة جيدا (1: 5 تمييع). ترك الخلايا لتسوية لمدة 5 دقائق قبل فحص الخلايا باستخدام مجهر مقلوب. ملاحظة: في خلايا SK1 نوع البرية، والجراثيم الناضجة المدمجة شكل من 36 ساعات بعد نقلها إلى وسائل الإعلام تبوغ. تقدم من خلال تبوغ يمكن رصدها بواسطة المجهر باستخدام علامات الفلورسنت، مثل علامة النووية (أي Htb2-mCherry 18) لفحص الميتوزي أو علامة غشاء prospore (أي G20 19) لدراسة بوغ التشكل. بدلا من ذلك، وتشكيل جراثيم سهل الانكسار ويمكن رؤيته باستخدام المجهر Nomarski مدينة دبي للإنترنت بدءا حوالي 12 ساعة بعد نقل إلى وسائل الإعلام تبوغ. </li></ol>

<ol><li>Marston, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+segregation+in+budding+yeast%3A+sister+chromatid+cohesion+and+related+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromosome segregation in budding yeast: sister chromatid cohesion and related mechanisms.</a> Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).</li>
<li>Keeney, S., Lange, J., Mohibullah, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+meiotic+recombination+initiation%3A+general+principles+and+molecular+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Self-organization of meiotic recombination initiation: general principles and molecular pathways.</a> Annu. Rev. Genet. 48, 187-214 (2014).</li>
<li>Granek, J. A., Kayikci, O., Magwene, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropic+signaling+pathways+orchestrate+yeast+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Pleiotropic signaling pathways orchestrate yeast development.</a> Curr. Opin. Microbiol. 14 (6), 676-681 (2011).</li>
<li>Broach, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+control+of+growth+and+development+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Nutritional control of growth and development in yeast.</a> Genetics. 192 (1), 73-105 (2012).</li>
<li>Winter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sum1%2FNdt80+transcriptional+switch+and+commitment+to+meiosis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76 (1), 1-15 (2012).</li>
<li>Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).</li>
<li>Padmore, R., Cao, L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+comparison+of+recombination+and+synaptonemal+complex+formation+during+meiosis+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Temporal comparison of recombination and synaptonemal complex formation during meiosis in S. cerevisiae.</a> Cell. 66 (6), 1239-1256 (1991).</li>
<li>Liti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+genomics+of+domestic+and+wild+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Population genomics of domestic and wild yeasts.</a> Nature. 458 (7236), 337-341 (2009).</li>
<li>McCusker, J. H., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+sporulation+of+yeast+in+media+buffered+near+pH6%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Efficient sporulation of yeast in media buffered near pH6.</a> J. Bacteriol. 132 (1), 180-185 (1977).</li>
<li>Codon, A. C., Gasent-Ramirez, J. M., Benitez, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+which+affect+the+frequency+of+sporulation+and+tetrad+formation+in+Saccharomyces+cerevisiae+baker%27s+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Factors which affect the frequency of sporulation and tetrad formation in Saccharomyces cerevisiae baker's yeasts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 61 (2), 630-638 (1995).</li>
<li>Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+sporulation+conditions+for+different+Saccharomyces+cerevisiae+strain+backgrounds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds.</a> Methods Mol. Biol. 557, 21-26 (2009).</li>
<li>Börner, G. V., Cha, R. S. Analysis of yeast sporulation efficiency, spore viability, and meiotic recombination on solid medium. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aB%C3%B6rner%2C+GV+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22">Cold Spring Harb. Protoc</a>. 2015 (11), 1003-1008 (2015).</li>
<li>Börner, G. V., Cha, R. S. Induction and analysis of synchronous meiotic yeast cultures. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aB%C3%B6rner%2C+GV+%22Cold+Spring+Harb.+Protocols%22">Cold Spring Harb. Protocols</a>. (10), 908-913 (2015).</li>
<li>Jones, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+library+for+comprehensive+overexpression+screens+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A systematic library for comprehensive overexpression screens in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat. Methods. 5 (3), 239-241 (2008).</li>
<li>Fleming, M. S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+yeast+plasmid+overexpession+screen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput yeast plasmid overexpession screen.</a> J. Vis. Exp. (53), e2836(2011).</li>
<li>Paulissen, S. M., Slubowski, C. J., Roesner, J. M., Huang, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timely+Closure+of+the+Prospore+Membrane+Requires+SPS1+and+SPO77+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Timely Closure of the Prospore Membrane Requires SPS1 and SPO77 in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. , (2016).</li>
<li>Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmberg%2C+DC+%22Methods+in+Yeast+Genetics%3A+A+Cold+Spring+Harbor+Labooratory+Manual%22">Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Labooratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2005).</li>
<li>Parodi, E. M., Baker, C. S., Tetzlaff, C., Villahermosa, S., Huang, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPO71+mediates+prospore+membrane+size+and+maturation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">SPO71 mediates prospore membrane size and maturation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Eukaryot. Cell. 11 (10), 1191-1200 (2012).</li>
<li>Nakanishi, H., de Los Santos, P., Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+regulation+of+a+SNARE+protein+by+control+of+intracellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Positive and negative regulation of a SNARE protein by control of intracellular localization.</a> Mol. Biol. Cell. 15 (4), 1802-1815 (2004).</li>
<li>Huang, L. S., Doherty, H. K., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Smk1p+MAP+kinase+negatively+regulates+Gsc2p%2C+a+1%2C3-beta-glucan+synthase%2C+during+spore+wall+morphogenesis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">The Smk1p MAP kinase negatively regulates Gsc2p, a 1,3-beta-glucan synthase, during spore wall morphogenesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102 (35), 13431-13436 (2005).</li>
</ol>

ليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة.

هنا نقدم بروتوكول للsporulating SK1 الخميرة في شكل multiwell 96. التهوية هي المفتاح للتبوغ كفاءة، الأمر الذي يتطلب استخدام إما بقضيب أو حبة الزجاج في كل بئر. عندما يتم sporulated الخلايا في لوحة multiwell 96 في حاضنة تهتز دون أي حبة أو بقضيب، الخلايا لا sporulate بكفاءة. وينظر فقط زيادة صغيرة في كفاءة تبوغ عندما يتم sporulated الخلايا دون أي حبة أو بقضيب في حاضنة تهتز، مقارنة يجري في 30 درجة مئوية دون التحريض (الجدول 1؛ 17٪ في شاكر مقابل 10٪ المفروضة على ضجة طبق)....

وقد درس تبوغ في الخميرة في مهدها لتقديم رؤى في جوانب كثيرة من الأحياء، بما في ذلك السيطرة على الفصل كروموسوم أثناء الانقسام الاختزالي 1، آليات إعادة التركيب الجيني 2، والسيطرة على التنمية من خلال خلية يشير 3، ومراقبة التغذية التنمية 4، والنسخي تنظيم التنمية 5، والنظر في تشكيل بوغ 6. يتضمن تشكيل بوغ حدث انقسام الخلايا رواية تنطوي على تشكيل المقصورات غشاء جديدة داخل الخلية الأم تليها ترسب جدار بوغ واقية 6. هذه الدراسات أن دراسة الخلايا sporulating في كثير من الأحيان الاستفادة من sporulating بسرعة الخميرة سلالة SK1، والتي يمكن أن تخضع لعملية تكاثر في حوالي 24 ساعة بطريقة فعالة نسبيا 7،8. وعلى الرغم من وصفت تحسين ظروف تبوغ لفي مهدها الخميرة 13/9، هذه التجربةالصورة فحص تبوغ على وسائل الاعلام الصلبة أو في جو من الثقافات السائل على نطاق وحين ينفذ تبوغ من استخدام أنابيب ثقافة أو قوارير. نحن هنا تصف طريقة لsporulating الخميرة في شكل لوحة multiwell 96. نجد أن لهذا الأسلوب، تهوية أمر بالغ الأهمية للتبوغ متزامن وكفاءة، وقد ابتكرت تقنيات لضمان تبوغ كافية لصغيرة الحجم شكل multiwell. Sporulating في شكل 96 لوحة multiwell يسمح للخلايا ليتم عرضه باستخدام تقنيات عالية الإنتاجية والكواشف الأمثل لشكل لوحة multiwell، مثل هذا الفحص لالمكثفات نسخة عالية باستخدام مكتبة مزينة بالبلاط 14-16.

<table><tbody><tr><td>Nunc 1.3 مل DeepWell Plates</td><td>ThermoScientific</td><td>260251</td><td>المستخدمة في التبوغ</td></tr><tr><td>Nunc 2.0 مل DeepWell Plates</td><td>ThermoScientific</td><td>278743</td><td>تستخدم لنمو ما قبل التبويض ، الخطوة 1.2.3</td></tr><tr><td>حبة زجاجية 3 مم</td><td>فيشر</td><td>11-312A</td><td>تستخدم في التبوغ</td></tr><tr><td>5 مم × 2 مم شريط التحريك ، عبوة من 12</td><td>فيشر</td><td>14-511-82</td><td>تستخدم للتبواغ</td></tr><tr><td>96 حسنا frogger</td><td>V & P Scientific</td><td>VP407</td><td>مطلوب للخطوة 1.2</td></tr><tr><td>ناسخة المكتبة</td><td>V& P Scientific</td><td>VP381</td><td>مطلوب للخطوة 1.2 ؛ لاستخدامه مع</td></tr><tr><td>طبق بتري المستطيل</td><td>frogger ThermoScientific</td><td>264728</td><td>اللازم للخطوة 1.2</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD</td><td>211677</td><td>مطلوب لوسائل الإعلام</td></tr><tr><td>مستخلص الخميرة</td><td>دينار</td><td>بحريني 212750</td><td>اللازم للوسائط</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>212750</td><td>اللازمة للوسائط</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>فيشر</td><td>D16-3</td><td>مطلوب للوسائط</td></tr><tr><td>أسيتات البوتاسيوم</td><td>فيشر</td><td>P171-500</td><td>اللازمة للوسائط</td></tr><tr><td>الجلسرين</td><td>فيشر</td><td>G33-500</td><td>اللازمة للوسائط</td></tr><tr><td>أسود 96 بئر لوحة سفلية زجاجية</td><td>MatTek</td><td>PBK96G-1.5.5-F</td><td>اللازمة للخطوة 2.4</td></tr></tbody></table>

تبوغ الفعال لل<em&gt; خميرة الخباز</em&gt; في تنسيق multiwell 96

Efficient Sporulation of Saccharomyces cerevisiae in a 96 Multiwell Format

خلال أوقات الإجهاد الغذائي ، تخضع خميرة الخميرة للكونين الأمشاجي ، والمعروف باسم الأبواغ. ستبدأ خلايا الخميرة ثنائية الصبغيات التي يتم تجويعاها للنيتروجين والكربون عملية التبواغ. تتضمن عملية التبوغ الانقسام الاختزالي متبوعا بتكوين الأبواغ ، حيث يتم تعبئة النوى أحادية الصيغة الصبغية في جراثيم مقاومة للبيئة. لقد طورنا طرقا للتبواغ الفعالة للخميرة الناشئة في 96 لوحة متعددة الآبار ، لزيادة إنتاجية خلايا الخميرة الغربلة للأنماط الظاهرية للأبواغ. تتوافق هذه الطرق مع الفحص باستخدام الخميرة المحتوية على البلازميدات التي تتطلب الاختيار الغذائي ، عند استخدام الحد الأدنى من الوسائط المناسبة ، أو مع فحص الخميرة مع التعديلات الجينومية ، عند استخدام نظام غني بالإسبوغ. وجدنا أنه بالنسبة لهذه الطريقة ، يعد التهوية أثناء التبوغ أمرا بالغ الأهمية لتكوين الأبواغ ، وقد ابتكرنا تقنيات لضمان تهوية كافية متوافقة مع تنسيق الألواح متعددة الآبار 96. على الرغم من أن هذه الطرق لا تحقق المستوى النموذجي ~ 80٪ من التبواغ الذي يمكن تحقيقه في التجارب القائمة على القارورة ذات الحجم الكبير ، إلا أن هذه الطرق ستحقق بشكل موثوق حوالي 50-60٪ من التبوغ في الألواح متعددة الآبار صغيرة الحجم.

<html> لتقييم هذا البروتوكول، وتمت مقارنة الكفاءة تبوغ تم الحصول عليها من sporulating الخلايا في لوحات multiwell (كما هو موضح أعلاه) إلى خلايا sporulated استخدام كميات أكبر في قوارير (الجدول 2). وقال إن استخدام لوحات multiwell لا يحقق كفاءة عالية ينظر عندما sporulating في قوارير، حيث كفاءة ~ 80٪ يمكن أن ينظر إليه بشكل روتيني. يمكن Sporulating في لوحات multiwell مع التهوية المناسبة (التي تقدمها الخرز الزجاجي أو أشرطة ضجة) تحقيق الكفا...

هنا ، يتم إجراء إبواغ خميرة الخميرة بتنسيق 96 متعدد الآبار.

تبوغ الفعال لل<em&gt; خميرة الخباز</em&gt; في تنسيق Multiwell 96

During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for ...

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تحفيز التبوغ في خميرة البرعمة بكفاءة باستخدام تنسيق 96 بئراً. وعلى الرغم من إجراء العديد من عمليات الفحص واسعة النطاق على خميرة البرعمة، إلا أن الدراسات عالية الإنتاجية التي تتناول الانقسام الاختزالي والتبوغ كانت محدودة. وتتميز التقنية الموضحة في هذا الفيديو بقدرتها على تحفيز تبوغ الخميرة بكفاءة وبطريقة اقتصادية في تنسيق 96 بئراً يتوافق مع الفحص عالي الإنتاجية.جاءتني الفكرة الأولى لهذه الطريقة لأنني أردت استخدام مكتبة بلازميدات 2-ميكرون مبلطة من أجل فحص الكابتات ذات العدد النسخي العالي لطافرة لم تتمكن من تكوين أبواغ منكسرة.ابدأ هذا الإجراء بإذابة سلالة خميرة SK1 على طبق مستخلص الخميرة والببتون والجلسرول أو طبق YPG. استخدم عصا معقمة لكشط كمية صغيرة من الخلايا من أنبوب التجميد الذي يحتوي على مخزون الجلسرول وافردها على طبق YPG. قم بتنمية الخميرة لمدة تتراوح من 12 إلى 16 ساعة عند 30 °C.بعد ذلك، قم بتخطيط الخميرة من طبق YPG على طبق مستخلص الخميرة والببتون والديكستروز، أو YPD، للحصول على مستعمرات مفردة. قم بتنمية الخميرة على طبق YPD لمدة تتراوح من 24 إلى 48 ساعة عند 30 درجة Celsius. وبعد 24 إلى 48 ساعة من النمو على وسط YPD الصلب، ابدأ بزراعة 25 milliliter من مستنبت YPD باستخدام مستعمرة مفردة من طبق YPD.قم بتنمية هذه المزرعة طوال الليل في حاضنة هزازة عند درجة حرارة 30 درجة Celsius وبسرعة 220 RPM حتى تصل الخلايا إلى كثافة ضوئية OD600 تتراوح بين 4.0 و 7.0. وفي اليوم التالي، استخدم كمية مناسبة من الخلايا من مزرعة YPD لبدء مزرعة بحجم 125 milliliter في وسط مستخلص الخميرة والببتون والأسيتات، أو YPA، بكثافة ضوئية OD600 تبلغ 0.1. قم بتنمية المزرعة في حاضنة هزازة عند درجة حرارة 30 درجة Celsius وبسرعة 220 RPM حتى تصبح OD600 بين 1.3 و 1.5.انقل المزرعة إلى أنابيب طرد مركزي وقم بتدويرها بسرعة 1800X G في جهاز طرد مركزي مكتبي لمدة خمس دقائق لترسيب الخلايا. اغسل الخلايا مرة واحدة بحجم 0.5 من الماء منزوع الأيونات المعقم بجهاز الأوتوكلاف. قم بالتدوير مرة أخرى وتخلص من الماء.أعد تعليق الخلايا في حجم 1X من وسط التبوغ. لتحضير خلايا ذات أنماط جينية مختلفة، يتم أولاً نقل الخلايا من المخزونات المجمدة المذابة في طبق متعدد الآبار سعة 96 بئراً إلى وسط YPG الصلب. قم بتعقيم أداة نقل ذات 96 سنًا (frogger) باللهب، ثم بردها لحظيًا على طبق من الوسط الصلب قبل ملامستها لمستعمرات الخميرة.قم بتنمية الخميرة طوال الليل عند 30 درجة مئوية. وفي اليوم التالي، انقل الخلايا من وسط YPG الصلب إلى وسط YPD أو الأوساط الصلبة الانتقائية، وذلك بناءً على النمط الجيني للسلالة. تم استخدام YPD في هذا العرض التوضيحي.قم بزراعة الخميرة عند 30 درجة Celsius حتى تتكون المستعمرات لكل سلالة. وزع 1.2 milliliters من وسط YPD السائل في كل بئر من طبق ذو 96 بئرًا عميقًا. انقل الخلايا من الوسط الصلب إلى الوسط السائل.قم بتغطية الطبق بغطاء بلاستيكي من طبق بتري مستطيل، وثبت الغطاء باستخدام قطعة من الشريط اللاصق لتقليل تقييد دوران الهواء إلى أدنى حد. قم بتنمية الخلايا طوال الليل في هزاز عند درجة حرارة 30 degree Celsius وبسرعة 220 RPM. وفي اليوم التالي، قم بإجراء عملية الطرد المركزي عند 1800X G لمدة خمس دقائق.قم بسكب الوسط الغذائي وأضف 500 microliters من YPA إلى كل بئر. ثم أعد تعليق الخلايا المترسبة. غطِّ الطبق بغطاء بلاستيكي وثبته باستخدام شريط لاصق.قم بتنمية الخلايا لمدة 15 ساعة في حاضنة هزازة عند درجة حرارة 30 degree Celsius وبسرعة 220 RPM. ولتوفير التهوية المناسبة لعملية التبوغ الفعالة، أضف إلى كل بئر من أطباق الـ 96 بئر إما خرزة زجاجية صلبة معقمة بقطر ثلاثة مليمتر أو قضيب تحريك مغناطيسي معقم بمقاس خمسة مليمتر في اثنين مليمتر. إذا كانت جميع الخلايا من نفس النمط الجيني، قم بتوزيع 500 microliters من الخلايا مع الوسط الغذائي في كل بئر من طبق الـ 96 بئر.قم بتغطية الطبق بغطاء بلاستيكي وثبته باستخدام الشريط اللاصق. إذا كانت الخلايا ذات أنماط جينية مختلفة، قم بطرد الخلايا الموجودة في YPA مركزياً عند 1800X G لمدة خمس دقائق ثم اسكب الوسط الغذائي. أضف 500 microliters من وسط التبوغ إلى كل بئر.ثم أعد تعليق الخلايا المرسبة في وسط التبوغ. غطِّ الطبق بغطاء بلاستيكي وثبته باستخدام شريط لاصق. في حالة استخدام الخرز الزجاجي، ضع العينات في حضانة هزازة عند درجة حرارة 30 °C وهزها بسرعة 220 RPM لإتمام عملية التبوغ.في حال استخدام قضبان تحريك مغناطيسية، ضع العينات على لوحة تحريك داخل حاضنة عند درجة حرارة 30 degrees Celsius من أجل التبوغ. لا تعد سرعة التحريك الدقيقة للقضبان المغناطيسية مهمة للغاية، شريطة أن تتحرك جميع القضبان بقوة وأن تكون المزرعة مهواة. بعد 36 hours، استعد العينات لمراقبة التقدم في عملية التبوغ.اسحب ستة ميكرولتر من الخلايا من كل مزرعة تَبَوُّغ وأضفها إلى 24 ميكرولتر من وسط التَبَوُّغ في طبق غطاء شرائح ذو 96 بئراً. اترك الخلايا تستقر لمدة خمس دقائق قبل فحصها باستخدام مجهر مقلوب. يظهر تَبَوُّغ ممثل لسلالتين مختلفتين في هذه الصور للخلايا التي تم تصورها باستخدام عدسة شيئية 63X على مجهر مقلوب.يمكن رؤية الرباعيات المنكسرة للضوء، والمشار إليها برؤوس الأسهم، في مستنبت النوع البري. ولكنها لا تظهر في المستنبت الذي يحتوي على خلايا smk1 المحذوفة والناقصة في عملية التبوغ. وقد أُجريت مقارنات بين كفاءات التبوغ للخلايا التي تبوغت في أطباق متعددة الآبار والخلايا التي تبوغت باستخدام أحجام أكبر في الدوارق.لم يحقق استخدام الأطباق متعددة الآبار الكفاءة العالية التي تُلاحظ عادةً عند استخدام البروتوكول الأكثر شيوعاً المتمثل في تكوين الأبواغ في الدوارق. ويمكن أن يؤدي تكوين الأبواغ في الأطباق متعددة الآبار مع التهوية المناسبة إلى تحقيق كفاءات تكوين أبواغ كافية تزيد عن 50%، حيث تم الحصول على أفضل النتائج باستخدام قضيب تحريك بطول خمسة مليمترات. ومع ذلك، ونظراً للتكلفة العالية لقضبان التحريك الصغيرة، فإن الكفاءات التي تم الحصول عليها باستخدام الخرز الزجاجي تعد مماثلة لها.على الرغم من أن قضبان التحريك بحجم خمسة مليمتر وسبعة مليمتر يتناسبان مع فجوات طبق متعدد الفجوات ذو 96 فجوة، إلا أن استخدام قضيب تحريك بحجم سبعة مليمتر أدى إلى ضعف كفاءة التبوغ. يميل قضيب التحريك بحجم سبعة مليمتر في الفجوة إلى التفاعل مع قضيب تحريك في الفجوة المجاورة، مما يمنع القضبان من التحريك بشكل صحيح ويحول دون توفير تهوية كافية للمستنبت.بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية تحفيز الخلايا الخميرية على التبَوْغ بكفاءة في وسط استزراع سائل باستخدام أطباق ذات 96 بئراً. وبمجرد إتقان هذه العملية، يمكن إتمامها في غضون ستة أيام إذا نُفذت بشكل صحيح. يمكن استخدام هذا الإجراء لفحص السلالات الطافرة المختلفة، أو البلازميدات، أو مثبطات الجزيئات الصغيرة لتقييم تأثيرها على الانقسام الاختزالي والتبَوْغ.بعد تطويرها، استُخدمت هذه التقنية لدراسة تنظيم الدورة الخلوية الانقسامية وكيفية ارتباط عملية تقسيم السيتوبلازم والانقسام الاختزالي في عملية التبوغ في خميرة Saccharomyces cerevisiae.

efficient-sporulation-saccharomyces-cerevisiae-96-multiwell

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

وهناك حاجة المجهرية من خلايا الخميرة عن التحليل الوراثي لتحديد الانتصافي أو بيضات ملقحة مضاعفا. وتنفذ هذه micromanipulations خارج باستخدام المجهر microneedle من تشريح. يستخدم لنقل microneedle الخلايا ، ويتم التحكم بها micromanipulator التي تتوفر مع درجات مختلفة من التشغيل الآلي.

تشريح السكيراء الجعوية زقاق

وتستخدم على نطاق واسع GFP الانصهار البروتينات لتصور العضيات بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. ومع ذلك ، الكشف عن الطفرات التي تؤثر في التشكل من العضيات يتطلب عموما الطفرات الفردية وقتا طويلا. هنا ، علينا أن نظهر وسيلة لدمج عضية في وقت واحد ، في GFP علامات الجينات غير الضرورية في 5000 ما يقرب من الخميرة.

أسلوب الإنتاجية العالية عالميا لدراسة مورفولوجية عضية في البيرة س.

في هذا البروتوكول التعبير الجيني ، في الخميرة...

تحليل لميكروأري السكيراء الجعوية</em

نحن هنا وصف شاشة overexpression في...

شاشة عالية الإنتاجية الخميرة Overexpression البلازميد

قمنا بتطوير شامل وغير متحيز الجينوم واسعة لفهم الجينات شاشات المخدرات وتفاعلات الجينات والبيئة. وتعرض وسائل للكشف عن هذه المجموعات متحولة.

الجينوم شاشات التنافسية للمكتبات الخميرة Barcoded

طريقة الوحش الأخضر تمكن الجمعية من الحذف السريع متعددة ملحوظ مع بروتين الجين الترميز مراسل الخضراء الفلورية. ويستند هذا الأسلوب على القيادة سلالات الخميرة من خلال دورات متكررة من تشكيلة الجنسي للالحذف ومضان على أساس تخصيب الخلايا تحمل أكثر الحذف.

عملية الوحش الأخضر لتوليد سلالات الخميرة حمل حذوفات متعددة الجينات

نقدم بروتوكولا مفصلا لإنشاء وفحص المكتبات الطافرة لحملات التطور الموجهة في خميرة الخميرة.

توجه طريقة تطور في<em&gt; خميرة الخباز</em&gt;: المسخ مكتبة الخلق والفرز

نقدم هنا بروتوكولا لتقدير الأيض معفن والجهاز التنفسي باحتواء النمو الأسى ل Saccharomyces cerevisiae لمعادلة النمو المتسارع. يسمح حساب المعلمات الحركية لفحص تأثيرات المواد/المركبات على التخمر أو التنفس المتقدرية.

Saccharomyces cerevisiae حركية النمو الهائل في الثقافة دفعة تحليل الأيض معفن والجهاز التنفسي

هنا، نقدم التصوير بالخلايا الحية وهو طريقة مجهرية غير سامة تسمح للباحثين بدراسة سلوك البروتين والديناميات النووية في خلايا الخميرة الانشطارية الحية أثناء الداء الميتوميوميس.

فحص الديناميات النووية الخميرة الانشطارية الميتومية وMeiotic عن طريق الفلورة الخلية الحية المجهرية

نقدم بروتوكولا لإعداد اللاميلا للعينات البيولوجية المجمدة من خلال التصوير الدقيق لشعاع الأيونات الذي يركز على التبريد للدراسات الهيكلية عالية الدقة للجزيئات الكبيرة في الموقع مع التصوير المقطعي للإلكترونات المبردة. يوفر البروتوكول المقدم مبادئ توجيهية لإعداد lamellae عالية الجودة مع استنساخ عالية لتوصيف الهيكلية للجزيئات الكلية داخل Cerevisiae Saccharomyces.

إعداد و Cryo-FIB micromachining من Saccharomyces cerevisiae للتصوير المقطعي كريو إلكترون

يوفر اختبار ACT1-CUP1 ، وهو فحص نمو النحاس ، قراءة سريعة لربط الحمض النووي الريبي رسول السلائف (pre-mRNA) وتأثير عوامل الربط الطافرة على وظيفة spliceosomal. توفر هذه الدراسة بروتوكولا وتسلط الضوء على التخصيص الممكن لمعالجة مسألة الربط ذات الأهمية.

تحدد فحوصات ACT1-CUP1 الحساسيات الخاصة بالركيزة للمتحولات spliceosomal في الخميرة الناشئة

تعلم تبوغ خميرة الخباز بكفاءة في صيغة 96 بئرًا لتمكين الفحص عالي الإنتاجية. تعالج هذه الطريقة تحديات التهوية لتحسين كفاءة التبوغ في دراسات الجينوم الوظيفي.

تبوغ الفعال لل

استكشف المزيد من الفيديوهات