تبوغ الفعال لل خميرة الخباز في تنسيق Multiwell 96

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تكاثر الخميرة الناشئة بكفاءة في شكل 96 بئرا. على الرغم من إجراء العديد من الشاشات واسعة النطاق على الخميرة الناشئة ، إلا أن الدراسات عالية الإنتاجية التي تبحث في الانقسام الاختزالي والجراثيم كانت محدودة. تتميز التقنية الموضحة في هذا الفيديو بميزة تكاثر الخميرة بكفاءة وبطريقة فعالة من حيث التكلفة بتنسيق 96 بئرا متوافقا مع الفحص عالي الإنتاجية.

خطرت لي فكرة هذه الطريقة لأول مرة لأنني أردت استخدام مكتبة بلازميد مبلطة بميكرونين من أجل فحص مثبطات النسخ العالية لمتحور لا يمكن أن يشكل جراثيم مقاومة للانكسار. في البداية ، كانت كفاءات الأبواغ الخاصة بي ضعيفة في تنسيق 96 بئرا. لقد وجدت أن هذا كان بسبب عدم كفاية التهوية.

ابدأ هذا الإجراء بإذابة سلالة الخميرة SK1 على مستخلص الخميرة ببتون الجلسرين أو لوحة YPG. استخدم عصا معقمة لكشط كمية صغيرة من الخلايا من قارورة الفريزر التي تحتوي على مخزون الجلسرين ونشرها على طبق YPG. ازرع الخميرة لمدة 12 إلى 16 ساعة عند 30 درجة مئوية.

بعد ذلك ، قم برسم الخميرة من صفيحة YPG على صفيحة سكر العنب الببتون أو YPD لمستخلص الخميرة لكولونات مفردة. ازرع الخميرة على صفيحة YPD لمدة 24 إلى 48 ساعة عند 30 درجة مئوية. بعد 24 إلى 48 ساعة من النمو على وسائط YPD الصلبة ، ابدأ زراعة YPD سعة 25 مليلتر باستخدام مستعمرة واحدة من لوحة YPD.

قم بزراعة هذه الثقافة بين عشية وضحاها في حاضنة اهتزاز 30 درجة مئوية بسرعة 220 دورة في الدقيقة حتى تصل الخلايا إلى OD600 من 4.0 إلى 7.0. في اليوم التالي ، استخدم كمية مناسبة من الخلايا من ثقافة YPD لبدء زراعة 125 مل لتر في أسيتات الببتون المستخلص من الخميرة ، أو YPA ، مع OD600 من 0.1. قم بزراعة المزرعة في حاضنة اهتزاز 30 درجة مئوية بسرعة 220 دورة في الدقيقة حتى يتراوح OD600 بين 1.3 و 1.5.

انقل المزرعة إلى أنابيب الطرد المركزي وقم بالدوران عند 1800 درجة مئوية في جهاز طرد مركزي منضدي لمدة خمس دقائق لتكسير الخلايا. اغسل الخلايا مرة واحدة بحجم 0.5 من الماء المعقم منزوع الأيونات. تدور مرة أخرى وتخلص من الماء.

أعد تعليق الخلايا في حجم 1X من وسائط التبوغم. لتحضير خلايا من أنماط وراثية مختلفة ، يتم أولا نقل الخلايا من المخزونات المجمدة المذابة في صفيحة متعددة الآبار 96 إلى وسائط YPG الصلبة. قم بإشعال شق 96 شق ثم قم بتبريده للحظات على طبق من الوسائط الصلبة قبل لمسه بمستعمرات الخميرة.

ازرع الخميرة بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية. في اليوم التالي ، انقل الخلايا من وسائط YPG الصلبة إلى YPD أو الوسائط الصلبة الانتقائية ، اعتمادا على النمط الجيني للسلالة. يتم استخدام YPD في هذا العرض التوضيحي.

ازرع الخميرة عند 30 درجة مئوية حتى تتشكل مستعمرات لكل سلالة. Aliquot 1.2 مل من الوسائط السائلة YPD في كل بئر من لوحة بئر عميقة 96. انقل الخلايا من الوسائط الصلبة إلى الوسط السائل.

قم بتغطية اللوحة بغطاء بلاستيكي من صفيحة بتري مستطيلة الشكل واثبت الغطاء في مكانه باستخدام قطعة من الشريط اللاصق لتقييد دوران الهواء إلى الحد الأدنى. قم بتنمية الخلايا طوال الليل في شاكر 30 درجة مئوية عند 220 دورة في الدقيقة. في اليوم التالي ، جهاز طرد مركزي عند 1800X G لمدة خمس دقائق.

اسكب الوسائط وأضف 500 ميكرولتر من YPA إلى كل بئر. وإعادة تعليق الخلايا المحببة. قم بتغطية الطبق بغطاء بلاستيكي مثبت في مكانه بواسطة شريط لاصق.

قم بتنمية الخلايا لمدة 15 ساعة في حاضنة اهتزاز 30 درجة مئوية عند 220 دورة في الدقيقة. لتوفير تهوية مناسبة للتكاثر الفعال ، أضف إلى كل بئر من صفيحة 96 بئرا إما حبة زجاجية صلبة معقمة بثلاثة ملليمترات أو قضيب تحريك مغناطيسي معقم بحجم خمسة ملليمترات × ملليمترين. إذا كانت جميع الخلايا من نفس النمط الجيني ، فقم بإدخال 500 ميكرولتر من الخلايا بالإضافة إلى الوسائط في كل بئر من اللوحة المكونة من 96 آرا.

قم بتغطية الطبق بغطاء بلاستيكي مثبت في مكانه بواسطة شريط لاصق. إذا كانت الخلايا من أنماط وراثية مختلفة ، فقم بتدوير الخلايا الموجودة في YPA عند 1800X G لمدة خمس دقائق واسكب الوسائط. أضف 500 ميكرولتر من وسائط التبويض إلى كل بئر.

وإعادة تعليق الخلايا المحببة في وسط التبويغ. قم بتغطية الطبق بغطاء بلاستيكي مثبت في مكانه بواسطة شريط لاصق. في حالة استخدام الخرز الزجاجي ، ضع العينات في حاضنة رج على حرارة 30 درجة مئوية ورجها عند 220 دورة في الدقيقة للتبواغ.

في حالة استخدام قضبان التحريك المغناطيسية ، ضع العينات على طبق تقليب داخل حاضنة 30 درجة مئوية للتبواغ. سرعة التحريك الدقيقة للقضبان المغناطيسية ليست مهمة جدا ، طالما أن جميع القضبان تتحرك بنشاط ويتم تهوية الثقافة. بعد 36 ساعة ، استرجع العينات لمراقبة التقدم من خلال التبواغ.

اسحب ستة ميكرولترات من الخلايا من كل مزرعة بواغية وأضف إلى 24 ميكرولترا من وسائط التبوغ في لوحة غطاء 96 بئر. اترك الخلايا لتستقر لمدة خمس دقائق قبل فحصها باستخدام مجهر مقلوب. يظهر بوغ تمثيلي لسلالتين مختلفتين في هذه الصور للخلايا التي تم تصورها باستخدام هدف 63X على مجهر مقلوب.

يمكن رؤية رباعيات الانكسار ، المشار إليها برؤوس الأسهم ، في الثقافة البرية. ولكن ليس في الثقافة التي تحتوي على خلايا حذف smk1 التي تعاني من نقص الأبواغ. تم إجراء مقارنات بين كفاءات التبواغ من الخلايا المتبوغة في ألواح متعددة الآبار والخلايا المتبوغة باستخدام كميات أكبر في القوارير.

لم يحقق استخدام الألواح متعددة الآبار الكفاءة العالية التي شوهدت بشكل روتيني عند استخدام البروتوكول الأكثر شيوعا للتبواغ في القوارير. يمكن أن يؤدي التبوغ في ألواح متعددة الآبار مع التهوية المناسبة إلى تحقيق كفاءات تكاثرية كافية تزيد عن 50٪ مع أفضل النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام قضيب تحريك بسعة خمسة ملليمترات. ومع ذلك ، نظرا للتكلفة العالية لقضبان التحريك الصغيرة ، فإن الكفاءات التي تم الحصول عليها باستخدام الخرز الزجاجي قابلة للمقارنة.

على الرغم من أن قضبان التحريك ذات الخمسة ملليمترات وسبعة ملليمترات تتناسب مع بئر صفيحة متعددة الآبار 96 ، إلا أن استخدام قضيب تحريك سبعة ملليمترات أدى إلى ضعف كفاءة التبواغ. يميل شريط التحريك الذي يبلغ طوله سبعة ملليمترات في البئر إلى التفاعل مع قضيب التحريك في بئر مجاور. منع القضبان من التقليب بشكل صحيح وتوفير تهوية كافية للثقافة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تكاثر خلايا الخميرة بكفاءة في الثقافة السائلة بتنسيق 96 بئرا. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه العملية في ستة أيام ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. يمكن استخدام هذا الإجراء لفحص السلالات الطافرة المختلفة أو البلازميدات أو مثبطات الجزيئات الصغيرة لتأثيرها على الانقسام الاختزالي والتبواغ.

بعد تطويرها ، تم استخدام هذه التقنية لدراسة تنظيم دورة الخلية الانتصافية وكيف يقترن الحركية الخلوية والانقسام الاختزالي في الأبواغ في خميرة