ال ذبابة الفاكهة تخيلي ورم القرص نموذج: التصور والكمي للالتعبير الجيني وغزو الورم عن طريق الفسيفساء الوراثية
October 6th, 2016
يوضح هذا البروتوكول كيفية توليد أورام نسيلي ملحوظ fluorescently، الذي يعرف وراثيا في ذبابة الفاكهة أقراص تخيلي antennal (EAD) العين /. فهو يصف كيفية تشريح EAD والدماغ من يرقات العمر الثالث وكيفية معالجتها لتصور وتحديد التغييرات التعبير الجيني وغزو الورم.
الهدف العام من هذا البروتوكول هو توضيح كيفية تشريح الأقراص والأدمغة الخيالية ذات الفاكهة التي تحمل المستنسخة المحددة وراثيا ذات العلامات الفلورية وكيفية معالجتها لتصور وقياس تغيرات التعبير الجيني وغزو الخلايا. يمكن أن تساعد الإجراءات الموصوفة في توفير رؤى جديدة حول دور الجينات والتطور الظهاري أو التوازن أو المرض وتشريح الآليات الكامنة وراء منافستها أو الانتشار التعويضي أو التعاون بين النسير. الميزة الرئيسية للدراسة هي أننا نقدم مجموعة كاملة من البروتوكولات المصممة خصيصا للتحليل الكمي والنوعي المتعمق للفسيفساء الجينية ذبابة الفاكهة.
بشكل عام ، يكافح الأفراد الجدد الذين يعملون مع نموذج ذبابة الفاكهة لأنهم لا يستطيعون التعرف على القرص التخيلي الهوائي للعين من القرص التخيلي الآخر. لتسهيل التعرف على القرص التخيلي الهوائي للعين الذي يحمل المستنسخة المميزة بالفلورسنت داخل جسم اليرقة ، يوصى بإجراء التشريح الأولي تحت المجهر الفلوري. يتيح تحليل الفسيفساء باستخدام علامة خلية قابلة للكبت أو MARCM توليد بقع نسيلة محددة وراثيا في سياق من النوع البري الظاهري.
يحفز FLP مدفوعا بواسطة محفز بلا عين إعادة التركيب بين عنصرين من عناصر FRT يحيطان بشريط توقف مميز بجين أصفر. بعد تكرار الحمض النووي ، يحفز FLP تبادل الكروماتيدات غير الشقيقة بين الكروموسومات المتجانسة التي تولد الكروماتيدات الشقيقة. أحدهما يحمل الأليل من النوع البري ومثبط Gal80 والآخر المتحور.
في الانقسام الفتيلي ، تنفصل هذه لإنتاج خليتين ابنتيتين ، إحداهما متحولة متماثلة اللواقح والأخرى من النوع البري. يسمح فقدان مثبط Gal80 بتعبير GFP في الطفرة بينما تظل الخلايا من النوع البري سلبية GFP. لبدء التجربة ، قم بحصاد يرقات الفسيفساء عن طريق رش PBS في زجاجة الذبابة لتغطية سطح الطعام.
ثم قم بتليين الطبقة العليا بملعقة واسكب ملاط الطعام الذي يحتوي على اليرقات في طبق بتري. اختر اليرقات برفق وانقلها إلى طبق جنين مليء ب PBS. اجمع ما لا يقل عن 20 يرقة للتلوين المناعي و 80 يرقة لتقدير توغل الورم.
اغسل اليرقات باستخدام PBS لإزالة جميع الأطعمة المتبقية. باستخدام مجهر ستيريو فلوري عند تكبير 8:16x ، حدد وتخلص من جميع يرقات النمر ، وهي تلك التي تعرض بقعا إيجابية عشوائية GFP في جميع أنحاء الجسم. ضع الطبق الذي يحتوي على اليرقات المتبقية في PBS على الثلج حتى التشريح.
لتشريح القرص التخيلي لهوائي العين تحت المجهر المجسم ، استخدم زوجا واحدا من الملقط وامسك اليرقة برفق عند حوالي 2/3 من طول الجسم خلف الرأس. باستخدام الزوج الثاني من الملقط ، أمسك خطافات فم اليرقات واسحبها بعيدا عن الجسم. باستخدام الملقط ، قم بفك ربط خطافات الفم عن البشرة المتراكبة والأنسجة الدخيلة مثل الغدد اللعابية والجسم الدهني.
بدلا من ذلك ، لتحضير مركب الدماغ القرصي الهوائي للعين ، مع الحفاظ على الحبل العصبي البطني سليما ، استخدم الملقط لقطع يرقة في منتصف الجسم. تجاهل النصف الخلفي. أمسك النصف الأمامي من جسم اليرقات بأطراف زوج واحد من الملقط ثم اقلب اليرقة من الداخل للخارج عن طريق دفع خطافات الفم إلى الداخل بطرف الزوج الثاني ولف البشرة فوقها باستخدام زوج الملقط الأول.
قم بإزالة جميع الأنسجة الدخيلة بعناية بما في ذلك الأمعاء والجسم الدهني والغدد اللعابية. اسحب خطافات الفم برفق بعيدا عن البشرة. حرر مركب الدماغ القرصي الهوائي للعين المتصل بخطافات الفم عن طريق قطع النتوءات المحورية الممتدة من الحبل العصبي البطني إلى العضلات والبشرة.
لنقل الأنسجة، قم أولا بتغطية طرف الماصة الدقيقة P20 عن طريق سحب جثث الجسم المتبقية لأعلى ولأسفل عدة مرات، ثم استخدم نفس الطرف لنقل الأنسجة التي تم تشريحها. لنقل مجمعات الدماغ الأكبر حجما للقرص الهوائي للعين ، قم بقص طرف P20 مسبقا لتكبير الفتحة. قم بإصلاح العينات في 400 لتر ميكرو من مثبت PFA بنسبة 4٪ لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أثناء التغذية.
ثم قم بإزالة المثبت وغسل العينات باستخدام PBST ثلاث مرات لمدة 10 دقائق مع التعويذة. بعد ذلك ، استبدل PBST ب 500 ميكرو لتر من محلول تلطيخ DAPI وقم بتسخينه لمدة 15 دقيقة في الظلام. اغسل المنديل مرة واحدة لمدة 10 دقائق باستخدام PBST.
لإكمال التشريح ، استخدم ماصة سعة مليلتر واحد لنقل الأنسجة مرة أخرى إلى طبق زجاجي مملوء ب PBS. باستخدام زوجين من الملقط يفصل الأدمغة لاستخدامها في القياس الكمي للغزو من أقراص هوائي العين عن طريق قطع السيقان البصرية. حرر أقراص هوائيات العين عن طريق قصها من خطافات الفم.
ضع قطرة من وسط التثبيت على شريحة مختطفة واستخدم الملقط وزع السائل في طبقة رقيقة. لتحديد الغزو ، ضع ما لا يقل عن 80 دماغا ثابتا سليما لكل نمط جيني في شريحة واحدة. قم بتصويب الأنسجة ووضعها حسب الرغبة.
المس برفق إحدى حواف الغطاء إلى الوسط وخفضها ببطء بمساعدة الملقط لتجنب تكوين فقاعات. استخدم مناديل معملية لامتصاص وسط التثبيت الزائد عند الحواف. يمكن الآن فحص الأنسجة باستخدام التصوير متحد البؤر.
اطلب من طرف محايد إخفاء هوية الشرائح بحيث يكون التسجيل غير متحيز. وقم بتقييم الشرائح بشكل مستقل من قبل باحثين على الأقل. الكشف عن الأنماط الجينية فقط بعد اكتمال التسجيل.
قم بتقييم درجة الورم الخبيث تحت مجهر استريو فلوري مزود بمجموعة مرشحات GFP. باستخدام علامة تسمية الأدمغة التي تم عرضها بالفعل لتجنب العد المزدوج. تظهر الصور الفلورية متحدة البؤر أدمغة تم تشريحها من اليرقات التي تحمل الأورام النسيلة الخبيثة RAS V12 المتوافقة مع GFP الملطخة ب DAPI.
تمثل اللوحات الدرجات الأربع المختلفة لغزو الورم. كشف القياس الكمي غير المتحيز أن تثبيط إشارات JNK و RAS V12 خربشة استنساخ واحد قمع غزو الورم. في أقراص هوائي العين ، يقوم مراسل TRE-DsRED الحساس ل JNK بتسمية شريط ضيق من الخلايا يمتد من الهوائي إلى جزء العين.
في المقابل ، تم تعزيز نشاط TRE-DsRED بشكل ملحوظ في الأورام النسيلة الخبيثة الإيجابية ل GFP. بحلول اليوم الثامن ، نمت الخلايا السرطانية في أقراص هوائيات العين وانتشرت إلى الحبل العصبي البطني. أظهرت الخلايا السرطانية الغازية أيضا زيادة في تنشيط JNK مقارنة بالأنسجة المحيطة.
في حين أن منع JNK قلل بوضوح من نشاط TRE-DsRED في استنساخ الورم ، فإن زيادة كثافة الليزر كشفت عن تحسن في الخلايا الظهارية المجاورة للنسخ. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر مراسل دلتا الهيمولكتين DsRED أنه على عكس عدد قليل من مجموعات الخلايا الدموية الموجودة في المسافات البادئة للهوائي في العين ، فإن الخلايا الدموية الظهارية المتراكمة في هوائي العين وأنسجة المخ المكونة من أورام خبيثة. عند تثبيط JNK ، انخفض عدد الخلايا المناعية المرتبطة بشكل كبير.
كان الغزو المعزز للورم ، ونشاط JNK ، وتسلل الخلايا الدموية مصحوبا بتنظيم كبير ل MMP1 mNRA كما حدده QRTPCR باستخدام إجمالي الحمض النووي الريبي المعزول من أقراص هوائيات العين الفسيفسائية التشريح. بمجرد إتقان أكثر من 60 زوجا من أقراص العين ويمكن تشريح الأدمغة في غضون 30 دقيقة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إنشاء عدد كاف من اليرقات من الأنماط الجينية المرغوبة.
كن سريعا ولكن دقيقا أثناء التشريح للحفاظ على العينات المخصصة لعزل الحمض النووي الريبي خالية من RNS. بعد إجراء التشريح ، يمكن استخدام اللطخة الغربية كبديل للتلطيخ المناعي لتقييم التغيرات في التعبير عن البروتين بين الأنماط الجينية المختلفة. يتيح إنشاء الفسيفساء الجينية وتحليلها باستخدام الإجراءات الموصوفة البحث عن الطفرات المميتة وآليات شركة الأورام وبعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تشريح أنسجة الفسيفساء من قرص هوائي العين والأدمغة من يرقات الطور الثالث وكيفية معالجتها من أجل التلوين المناعي ، وتصور النشاط المعدل وراثيا والمنفذ ، استخراج الحمض النووي الريبي ، والتقدير الكمي للغزو.
يجب تذكيرك بأن PFA وكذلك الفينول كلوروفورم و DAPI شديدة السمية وأنه يجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات والملابس الواقية أثناء العمل مع هذه العوامل.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
الموجز
يوضح هذا البروتوكول كيفية تشريح أقراص الخيال الموجود في عين الذباب المجنحة والعقول لتصوير وتحديد تغيرات التعبير الجيني والقدرة على غزو الورم. ويوفر مجموعة شاملة من البروتوكولات لتحليل النسخ الوراثية المميزة باللون الفلوري.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الوراثة
- علم الأحياء التنموي
الخلفية
- تعمل ذبابة الفاكهة ككائن حي نموذجي لدراسة الفسيفساء الوراثية.
- أقراص الخيال في العين والهوائي ضرورية لفهم تطور الظهارة.
- تساعد العلامات الفلورية في تحديد المستعمرات المحددة.
- فهم منافسة الجينات والتكاثر ضروري للحصول على رؤى حول آليات المرض.
هدف الدراسة
- توفير بروتوكولات لتشريح أنسجة الذباب المجنحة.
- لتصوير تغيرات التعبير الجيني في الأورام المستعمرية.
- لتحديد قدرة ورم على الغزو والتفاعلات الخلوية.
الطرق المستخدمة
- تشريح يرقات المرحلة الثالثة للحصول على أقراص العين والهوائي والعقول.
- استخدام التصوير المجهري الفلوري للتشريح الأولي.
- تحليل الفسيفساء باستخدام علامة خلوية قابلة للكبح (MARCM).
- تحليل كمي ونوعي للموائل الجينية.
النتائج الرئيسية
- نجاح توليد أورام مستعمرية مضاءة بالفلورسنت.
- تصوير تغيرات التعبير الجيني في نموذج الذباب المجنحة.
- رؤى حول آليات قدرة الخلايا على الغزو والمنافسة.
- فهم محسن لتوازن الظهارة والمرض.
الخلاصات
- تُمكّن البروتوكولات من تحليل مفصل للتفاعلات الجينية في الذباب المجنحة.
- تسهّل العلامات الفلورية دراسة الديناميكيات المستعمرية.
- تساهم النتائج في فهم علم الأحياء التنموي وآليات المرض.
الأسئلة المتكررة
Executive Industry Relevance
The Drosophila imaginal disc tumor model provides a genetically tractable system for mechanistic de-risking of oncogenic pathways and tumor-stroma interactions in a whole-organism context. By enabling visualization and quantification of gene expression changes and cellular invasiveness in defined genetic mosaics, the approach supports target validation and phenotypic screening in early discovery. It offers a disease-relevant system for assessing mechanistic drivers of tumor progression with predictive confidence for downstream translational efforts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing gene expression changes in fluorescently marked clonal tumors.
- Scientific Value: Supports functional target validation through MARCM-generated mosaics that isolate mutant clones in wild-type tissue.
- Scientific Value: Facilitates biological de-risking by quantifying tumor invasiveness and associated stromal responses such as hemocyte infiltration and MMP1 upregulation.
Screening & Assay Development
- Operational Value: Provides a standardized dissection and fixation workflow for preparing eye-antennal discs and brains for immunostaining and transgenic reporter visualization.
- Operational Value: Enables quantitative assessment of invasiveness through blinded scoring of blinded slides by multiple researchers, reducing cognitive bias.
- Operational Value: Supports RNA isolation from dissected tissues for gene expression profiling via qRT-PCR or genome-wide approaches.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Links genetic manipulations to phenotypic outcomes in a disease-relevant system modeling epithelial tumor progression.
- Translational Value: Supports mechanistic de-risking by connecting JNK signaling inhibition to reduced tumor invasiveness and immune cell recruitment.
- Translational Value: Offers a platform for testing genetic or pharmacological modifiers of tumor-stroma interactions in vivo.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a scalable system for hypothesis testing, pathway clarification, and phenotypic readouts that inform lead identification and preclinical prioritization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through visualization of transgenic reporters and antibody staining in defined genetic mosaics.
- Screening: Enables assay readiness via standardized tissue recovery, fixation, and staining protocols compatible with multiple transgenic lines and antibodies.
- Analytics: Generates quantitative outputs such as invasiveness scores and gene expression levels that allow comparative analysis across genotypes.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by modeling tumor invasiveness and stromal engagement in a whole-organism context.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying genetic interactions, oncogene cooperation, and tumor progression mechanisms across multiple larval stages and genotypes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in tumor-stroma and genotype-phenotype relationships.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized dissection, fixation, and blinded quantification procedures.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of oncogenic potency and microenvironmental engagement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing quantitative data on tumor aggressiveness and molecular markers of progression.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila handling, fluorescent microscopy, and genetic mosaic techniques such as MARCM.
- Dependent on instrumentation including fluorescent and confocal microscopes, microtomes for slide preparation, and RNA isolation tools.
- Necessitates cross-team standardization for tissue dissection, staining, and scoring to ensure consistency across users and experiments.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different larval stages, genotypes, or transgenic reporters.
- Includes practical limitations such as the need for large larval numbers (≥80 for invasiveness quantification) and careful handling to avoid RNA degradation during dissection.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:16
Genetic Crosses and Collection of Third Instar Larvae
3:10
Dissection of Larvae
4:52
Fixing and Staining of Tissues
5:58
Tissue Mounting and Quantification of Tumor Invasiveness
7:10
Results: Visualization, Tumor Quantification, and Gene Expression
9:04
Conclusion
