تطبيقات pHluorin لالكمي، الحركية وعالية الإنتاجية تحليل الإلتقام في مهدها الخميرة

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس أحداث النقل الحويصلي في مسار الالتقام الخلوي للخلايا الحية. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال النقل الحويصلي، مثل كيفية تأثير الطفرات أو التغيرات في التعبير البروتيني على معدلات وكفاءة أحداث النقل. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تتيح القياس الكمي المباشر للنقل الالتقامي في الخلايا الحية عن طريق قياس شدة البروتينات الحمولة المميّزة بفلوروفورات.

بعد تحضير المحاليل والأوساط وفقاً لبروتوكول النص، قم بتلقيح مستعمرتين إلى ثلاث مستعمرات من خلايا الخميرة في 5 mL من وسط YNB، الخالي من العناصر الغذائية الإضافية للحفاظ على اصطفاء البلازميد. قم بتنمية المزارع عند 30 °C مع الرج لمدة تتراوح من 16 إلى 24 ساعة. وقبل التصوير بنحو ثلاث ساعات، قم بقياس OD 600 لكل مزرعة نمت طوال الليل.

بعد ذلك، قم بتحضير تخفيفات بحجم خمسة ملليلتر بكثافة ضوئية OD 600 تتراوح بين 0.35 إلى 0.4 في وسط YNB، الخالي من المغذيات الإضافية اللازمة للحفاظ على البلازميد، وقم بتنميتها عند درجة حرارة 30 درجة مئوية مع الرج لمدة ثلاث ساعات. وأثناء فترة الحضن، قم بتهيئة الغرفة البيئية للمجهر أو المنصة المسخنة مسبقاً لتصل إلى 30 درجة مئوية. وبعد تحضير وعاء زجاجي بثماني فجوات وشريحة غرفة للتصوير وفقاً لبروتوكول النص، أضف 200 ميكرولتر من وسط YNB الخالي من المغذيات الإضافية اللازمة لاختيار البلازميد إلى كل فجوة.

عندما تصبح المزارع جاهزة، انقل 1 mL إلى أنبوب مبرد دقيق وقم بترسيب الخلايا بسرعة 8,000 RPM لمدة دقيقتين. بعد ذلك، قم بإزالة 975 µL من الطافي. أعد تعليق كتلة الخلايا المترسبة في الطافي المتبقي.

بعد ذلك، قم بإسقاط 2.5 µL من معلق الخلايا في مركز كل بئر من آبار اللوحة المكونة من ثمانية آبار. استخدم الماصة للسحب والدفع من أجل توزيع الخلايا، واترك الخلايا لتستقر لمدة تتراوح بين 5 إلى 10 دقائق. ضع شريحة الغرفة على مجهر فلوري مقلوب تمت موازنته عند درجة حرارة 30 °C.

بعد ذلك، استخدم إضاءة المجال المضيء لتحديد حقل من الخلايا. أضف 50 µL من وسط YNB المُدفأ مسبقاً والذي يحتوي على 100 µg/mL من الميثيونين إلى 200 µL من الوسط الموجود في البئر للحصول على تركيز نهائي من الميثيونين يبلغ 20 µg/mL. اترك الخلايا لتتوازن لمدة دقيقتين قبل البدء في التصوير.

ثم مباشرةً قبل التصوير، اضبط المجهر على المستوى البؤري المطلوب. قم بالتقاط صور GFP بنظام المجال المضيء (bright field) أو بنظام تباين التداخل التفاضلي (DIC) على فترات زمنية مدتها 5 دقائق لمدة تتراوح من 45 إلى 60 دقيقة، مع استخدام معاملات التقاط متطابقة لجميع الصور ضمن السلسلة الزمنية الواحدة.

يرجى الرجوع إلى البروتوكول المكتوب للحصول على تفاصيل إضافية. قم بقياس شدة الفلورة للخلايا الفردية عند كل نقطة زمنية، وعبّر عن القيم كنسبة مئوية من الشدة الأولية للصورة الأولى. بعد تصدير الصور وفقاً للبروتوكول المكتوب في برنامج image j، افتح الملفات من قائمة الملفات باستخدام خيار Open.

استخدم صورة الفلورة لغرض التكميم، واستخدم صورة المجال المضيء أو صورة تباين التداخل التفاضلي (DIC) كمرجع لتحديد موقع الخلايا. استبعد الخلايا الميتة الموجودة والتي تظهر بلون أدكن من الخلايا الحية عند عرضها بواسطة تباين التداخل التفاضلي (DIC) وتظهر فلورة ذاتية تحت قناة GFP. بالنسبة للصور ذات الخلفية غير المتساوية، اختر خوارزمية طرح الخلفية من قائمة المعالجة (Process) واختر الإعداد الافتراضي.

بمجرد الحصول على الصور، من المهم إجراء عملية طرح الخلفية قبل البدء في إجراء القياس الكمي. وتكتسب هذه الخطوة أهمية خاصة لأن إشارة الخلفية قد تحجب أو تضعف الفروق بين العينات بخلاف ذلك. باستخدام أداة التحديد الحر، قم بتحديد محيط خلية مع التأكد من تضمين الخلية بأكملها وبأقل مساحة ممكنة خارج حدود الخلية.

بعد ذلك، من قائمة Analyze، استخدم وظيفة set measurements لقياس المساحة (area)، والكثافة المتكاملة (integrated density)، وقيمة الرمادي المتوسطة (mean gray value). افتح مدير المناطق ذات الاهتمام (ROI Manager) بالنقر على Analyze، ثم Tools. وفي نافذة ROI Manager، انقر على زر Add لإدراج المنطقة المظللة كمنطقة اهتمام (ROI) جديدة.

كرر عملية تحديد المخططات وأخذ القياسات للخلايا المتبقية في الصورة، مع استبعاد أي خلايا ميتة أو خلايا تلامس حافة الصورة. احفظ مناطق الاهتمام (ROIs) المختارة كملف zip من خلال النقر على زر القياس (measure)، والذي سيعرض القيم المقاسة في نافذة جديدة. ثم انقر على زر "المزيد" (more) وقم بتصدير جميع القياسات إلى جدول بيانات أو برنامج تحليل إحصائي.

قم بتلقيح مستعمرتين إلى ثلاث مستعمرات من خلايا الخميرة في 0.5 milliliters من وسط YNB، الخالي من المغذيات الإضافية اللازمة للحفاظ على اختيار البلازميد. قم بنمو الخلايا على أسطوانة دوارة عند 30 درجة مئوية لمدة تتراوح من 16 إلى 24 ساعة. أضف 1 milliliter من وسط YNB الخالي من المغذيات الإضافية للحفاظ على البلازميد واتركها تنمو لمدة ثلاث ساعات إضافية.

بعد ذلك، انقل 1 mL من الخلايا إلى كل أنبوب من أنبوبين بقاع مستدير سعة 5 mL. ثم أضف 0.25 mL من وسط YNB Met إلى الأنبوب الأول، و0.25 mL من وسط YNB الذي يحتوي على 100 µg/mL من الميثيونين إلى الأنبوب الثاني للوصول إلى تركيز نهائي قدره 20 µg/mL. في حالة وجود عدد كبير من العينات، قم بجدولة إضافة الميثيونين على فترات زمنية متباعدة لإتاحة الوقت اللازم لإجراء تحليل الحقائق.

يمكن لجهاز قياس التدفق الخلوي لدينا قياس ما يصل إلى 40 عينة في الدورة الواحدة. نقوم بإضافة الميثيونين على دفعات، بواقع ثماني عينات كل خمس دقائق.

يضمن ذلك قياس جميع العينات في فترة تتراوح بين 45 و50 دقيقة بعد إضافة الميثيونين. يتم تحضين الخلايا لمدة 45 دقيقة، ثم تُحلل الخلايا بواسطة قياس التدفق الخلوي (flow cytometry)، مع اختيار التشتت الأمامي أو FS كمقياس لحجم الخلية، وتعيين شدة فلورية واحدة من مرشح FITC كمقياس لاستيعاب الشحنة داخلياً.

خلال فترة الحضانة التي تستمر لمدة 45 دقيقة، استخدم أزرار التمرير لضبط جهد قناتي FS وFITC لتحسين الكشف بما يتناسب مع نطاق الحجم وشدة الفلورة لخلايا الخميرة المستخدمة. قم بقياس FS وشدة الفلورة لـ 10,000 خلية من كل حالة. وباستخدام إعداد معدل التدفق العالي، قم بإنشاء مخطط تشتت لـ FS مقابل شدة الفلورة من خلال النقر على إضافة رسم بياني.

بعد ذلك، اختر FITC للمحور السيني و FS للمحور الصادي وقم برسم 1000 نقطة. وباستخدام وظيفة البوابة (gate function) وحالة Met من النوع البري (wild type)، حدد بوابة عمودية بحيث يقع حوالي 5% من الخلايا الأكثر سطوعاً على يمين البوابة. استخدم هذه البوابة لجميع الحالات الأخرى في التجربة.

كما هو موضح هنا، تم إجراء تصوير فاصل زمني للخلايا بفاصل خمس دقائق في حالة عدم وجود الميثيونين أو وجوده لمراقبة استدخال Mup1 المرتبط بـ GFP أو الفلورين والتغيرات في الفلورة. وكما كان متوقعاً، ظل Mup1 المرتبط بـ GFP والفلورين عند الغشاء البلازمي في حالة عدم وجود الميثيونين. وفي المقابل، أظهرت الخلايا التي تم تصويرها في وجود الميثيونين استنفاداً تدريجياً لإشارة الفلورة من سطح الخلية، وهو ما يتفق مع عملية استدخال الشحنة.

ومع ذلك، فقد تأخرت حركية فقدان الفلورة في وجود الميثيونين في خلايا Mup1 GFP مقارنة بخلايا pHlourin Mup1. وتقارن مخططات التشتت هذه شدة الفلورة في خلايا النوع البري أو أربع خلايا delta ENTH1 في وجود الميثيونين أو غيابه بعد تطبيق بوابة عمودية. وقد وُجد أن 4% من خلايا Met من النوع البري تقع على الجانب الأيمن من البوابة، وهو ما يقابل الخلايا الأكثر سطوعاً في المجموعة، بينما وقعت 65% من خلايا النوع البري غير المعالجة ضمن البوابة.

في المقابل، لم تظهر الخلايا الأربع من نوع delta ENTH1 أي اختلاف في توزيع الخلايا الساطعة مقابل الخلايا الخافتة، وهو ما يتوافق مع وجود خلل في عملية الالتقام الخلوي. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ثلاث إلى أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر تعيين أوقات بدء متفاوتة عند إجراء تجارب متزامنة، بحيث يمكن جمع بيانات نقطة النهاية بعد نفس مدة المعالجة لجميع العينات.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل الفحص الجيني الزهري (floral genetic screens) من أجل الإجابة على أسئلة إضافية، مثل العوامل الجديدة التي تساهم في النقل الحويصلي. وقد مهدت هذه التقنية، بعد تطويرها، الطريق للباحثين في مجال النقل الحويصلي لاستكشاف جوانب تآكل الأجسام الداخلية (endosome attrition)، بالإضافة إلى مسار حمضي ومستقل عن الكلاثرين تم اكتشافه حديثًا في خميرة التبرعم. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام الشحنات من نوع florent لتقدير أحداث الالتقام الخلوي في الخلايا الحية.