تطبيقات pHluorin لالكمي، الحركية وعالية الإنتاجية تحليل الإلتقام في مهدها الخميرة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد أحداث الاتجار الحويصلي في المسار الداخلي للخلايا الحية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الاتجار الحويصلي مثل كيفية تأثير الطفرة أو التغيرات في التعبير عن البروتين على معدلات وكفاءة أحداث الاتجار. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالقياس الكمي المباشر لتهريب الخلايا الداخلية والخلايا الحية عن طريق قياس شدة بروتينات الشحن ذات العلامات الفلورية.

بعد تحضير المحاليل والوسائط وفقا لبروتوكول النص ، قم بتلقيح مستعمرتين إلى ثلاث من خلايا الخميرة في خمسة ملليلتر من وسط YNB ، تفتقر إلى العناصر الغذائية الإضافية للحفاظ على اختيار البلازميد. تنمو الثقافات عند 30 درجة مئوية مع الرج لمدة 16 إلى 24 ساعة. قبل التصوير بثلاث ساعات تقريبا ، قم بقياس OD 600 لكل ثقافة ليلية.

ثم قم بإعداد خمسة تخفيفات مليلتر عند OD 600 من 0.35 إلى 0.4 في وسط YNB ، وتفتقر إلى العناصر الغذائية الإضافية لصيانة البلازميد وتنمو عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز لمدة ثلاث ساعات. أثناء الحضانة ، قم بموازنة المجاهر في الغرفة البيئية أو المرحلة الساخنة إلى 30 درجة مئوية. بعد تحضير وعاء زجاجي معالج بثمانية آبار وشريحة غرفة للتصوير وفقا لبروتوكول النص ، أضف 200 ميكرولتر من وسط YNB الذي يفتقر إلى العناصر الغذائية الإضافية لاختيار البلازما لكل بئر.

عندما تكون الثقافات جاهزة ، انقل ملليلترا واحدا إلى أنبوب ثلاجة صغيرة وحبيبات الخلايا عند 8 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين. ثم قم بإزالة 975 ميكرولتر من المادة الطافية. أعد تعليق حبيبات الخلية في المادة المطفية المتبقية.

ثم قم بإسقاط 2.5 ميكرولتر من تعليق الخلية في وسط كل بئر من اللوحة المكونة من ثمانية آبار. الماصة لأعلى ولأسفل لتفريق الخلايا والسماح للخلايا بالاستقرار لمدة خمس إلى 10 دقائق. ضع شريحة الغرفة على مجهر مضان مقلوب متوازن حتى 30 درجة مئوية.

بعد ذلك ، استخدم إضاءة المجال الساطع لتحديد مجال الخلايا. أضف 50 ميكرولترا من وسط YNB الدافئ مسبقا والذي يحتوي على 100 ميكروغرام لكل مليلتر من الميثيونين إلى 200 ميكرولتر من الوسط في البئر للحصول على تركيز نهائي للميثيونين يبلغ 20 ميكروغراما لكل ملليلتر. اسمح للخلايا بالتوازن لمدة دقيقتين قبل بدء التصوير.

ثم مباشرة قبل التصوير ، اضبط المجهر على المستوى البؤري المطلوب. احصل على GFP في مجال ساطع أو صور DIC على فترات مدتها 5 دقائق لمدة 45 إلى 60 دقيقة. استخدام معلمات اكتساب متطابقة لجميع الصور ضمن سلسلة زمنية.

راجع بروتوكول النص للحصول على تفاصيل إضافية. حدد كثافة التألق للخلايا الفردية في كل نقطة زمنية وعبر عن القيم كنسبة مئوية من الكثافة الأولية للصورة الأولى. بعد تصدير الصور وفقا لبروتوكول النص في الصورة j ، افتح الملفات في قائمة الملفات باستخدام ملف فتح اختيار.

استخدم صورة التألق للقياس الكمي والمجال الساطع أو صورة DIC كمرجع لتحديد موقع الخلايا. استبعاد الخلايا الميتة من الحاضر التي تبدو أغمق من الخلايا الحية عند عرضها بواسطة DIC و autofluoresce تحت قناة GFP. بالنسبة للصور ذات الخلفية غير المستوية في القائمة Process، اختر خوارزمية طرح الخلفية واختر الإعداد الافتراضي.

بمجرد الحصول على الصور ، من المهم إجراء طرح الخلفية قبل متابعة إجراء القياس الكمي. هذه الخطوة مهمة بشكل خاص لأن إشارة الخلفية يمكن أن تخفي أو تخفف الاختلافات بين العينات. باستخدام أداة التحديد اليدوي ، حدد الخطوط العريضة للخلية مع التأكد من تضمين الخلية بأكملها ولكن أقل مساحة ممكنة خارج الخلية.

ثم ضمن قائمة التحليل، استخدم وظيفة تعيين القياسات لقياس المساحة والكثافة المتكاملة ومتوسط القيمة الرمادية. افتح مدير عائد الاستثمار بالنقر فوق تحليل ، ثم أدوات. في نافذة مدير العائد على الاستثمار ، انقر فوق الزر إضافة لإدخال المنطقة المميزة كعائد استثمار جديد.

كرر المخطط التفصيلي والقياس للخلايا المتبقية في الصورة، باستثناء أي خلايا ميتة أو خلايا تلامس حافة الصورة. احفظ عائد الاستثمار المحدد كملف مضغوط بالنقر فوق زر القياس الذي سيعرض القيم المقاسة في نافذة جديدة. ثم انقر فوق الزر "المزيد" وقم بتصدير جميع القياسات إلى جدول بيانات أو برنامج تحليل إحصائي.

تلقيح مستعمرتين إلى ثلاث مستعمرات من خلايا الخميرة و 0.5 مل من وسط YNB ، تفتقر إلى العناصر الغذائية الإضافية للحفاظ على اختيار البلازميد. قم بزراعة الخلايا على أسطوانة أسطوانية عند 30 درجة مئوية لمدة 16 إلى 24 ساعة. أضف ملليلترا واحدا من وسط YNB الذي يفتقر إلى العناصر الغذائية الإضافية لصيانة البلازميد وتنمو لمدة ثلاث ساعات إضافية.

بعد ذلك ، انقل مليلتر واحد من الخلايا إلى كل من أنبوبين سفعيين دائريين سعة خمسة ملليلتر. ثم أضف 0.25 مل من وسيط YNB Met إلى الأنبوب الأول و 0.25 مل من وسط YNB الذي يحتوي على 100 ميكروغرام لكل مليلتر من الميثيونين إلى الأنبوب الثاني للحصول على تركيز نهائي قدره 20 ميكروغرام لكل مليلتر. بالنسبة لعدد كبير من العينات ، قم بترتيب إضافة الميثيونين لاستيعاب الوقت لتحليل الحقائق.

يمكن لمقياس التدفق الخلوي الخاص بنا قياس ما يصل إلى 40 عينة في كل شوط. نضيف الميثيونين على دفعات. ثماني عينات كل خمس دقائق.

هذا يضمن قياس جميع العينات بين 45 و 50 دقيقة بعد إضافة الميثيونين. احتضان الخلايا لمدة 45 دقيقة. ثم قم بتحليل الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي ، واختيار التشتت الأمامي أو FS كمقياس لحجم الخلية وتعيين شدة مضان متدفق واحد من مرشح FITC كمقياس لاستيعاب البضائع.

خلال فترة الحضانة التي تستغرق 45 دقيقة ، استخدم أزرار شريط التمرير لضبط جهد قنوات FS و FITC لتحسين الكشف عن نطاق الحجم وشدة التألق لخلايا الخميرة المستخدمة. قم بقياس FS وشدة التألق ل 10 ، 000 خلية من كل حالة. باستخدام إعداد معدل التدفق العالي، قم بإنشاء مخطط مبعثر ل FS مقابل شدة التألق بالنقر فوق إضافة رسم بياني.

ثم حدد FITC للمحور x و FS للمحور y ورسم بياني 1000 نقطة. باستخدام وظيفة البوابة والنوع البري حالة Met ، قم بتعيين بوابة رأسية بحيث يقع ما يقرب من 5٪ من الخلايا الأكثر سطوعا على يمين البوابة. استخدم هذه البوابة لجميع الحالات الأخرى في التجربة.

كما هو موضح هنا ، تم إجراء التصوير بفاصل زمني للخلايا على فترات خمس دقائق في غياب أو وجود الميثيونين لمراقبة GFP أو الفلور الموسوم ب Mup1 والتغيرات في التألق. كما هو متوقع ، ظل GFP والفلور الموسوم Mup1 في غشاء البلازما في غياب الميثيونين. في المقابل ، أظهرت الخلايا التي تم تصويرها في وجود الميثيونين استنزافا تدريجيا لإشارة الفلورسنت من سطح الخلية بما يتفق مع استيعاب البضائع.

ومع ذلك ، فقد تأخرت حركية التألق المفقودة في وجود الميثيونين في خلايا Mup1 GFP مقارنة بخلايا pHlourin Mup1. تقارن مخططات التشتت هذه شدة التألق لخلايا دلتا ENTH1 من النوع البري أو أربع خلايا دلتا في وجود أو عدم وجود الميثيونين بعد تطبيق بوابة عمودية. تم احتواء 4٪ من خلايا Met من النوع البري على الجانب الأيمن من البوابة المقابلة لألمع الخلايا في السكان ، بينما تم احتواء 65٪ من الخلايا البرية غير المعالجة في البوابة.

في المقابل ، لم تظهر خلايا دلتا ENTH1 الأربعة أي فرق في توزيع الخلايا الساطعة مقابل الخلايا الخافتة ، بما يتفق مع عيب في الالتقام الخلوي. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ثلاث إلى أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر ترتيب أوقات البدء من إجراء التجارب المتزامنة ، بحيث يمكن جمع بيانات نقطة النهاية بعد نفس وقت المعالجة لجميع العينات.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الشاشات الجينية الزهرية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل العوامل الجديدة التي تساهم في الاتجار بالحويصلات. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الاتجار الحويصلي لاستكشاف جوانب استنزاف الجسيمات الداخلية بالإضافة إلى مسار الكلاثرين المستقل والحمضي المكتشف حديثا في الخميرة الناشئة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام الشحنات من النوع الفلوراني لتحديد أحداث الخلايا الداخلية في الخلايا الحية.