والاستشعار القائم بولي آنلين من الأحماض النووية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصنيع مادة البولي أنيلين المشتتة بالماء والتي يمكن استخدامها للكشف عن الأحماض النووية بطريقة خالية من الملصقات. هذه التقنية هي طريقة فعالة من حيث التكلفة للكشف عن الأحماض النووية. ستجد المختبرات التي تتبناها سهلا وقويا وحساسا.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها خالية من الملصقات ويمكن استخدامها للكشف مباشرة عن الحمض النووي الريبي والحمض النووي دون الحاجة إلى التلاعب الأنزيمي. هذه التقنية لديها إمكانات لتقنيات تشخيصية جديدة وبما أنها لا تستخدم ملصقا ، يمكن استخدامها لمعالجة عينات المرضى مع القليل من التلاعب. سيساعد العرض المرئي في إزالة الغموض عن المستشعر.

تتضمن هذه المنصة علوم البوليمر وعلم الأحياء ، والتي تبدو غريبة للغاية ولكنها في الواقع سهلة التنفيذ للغاية. قم بإذابة الأنيلين تماما في 60 مل من الكلوروفورم في قارورة دائرية القاع سعة 250 مل. بعد التقليب عند 600 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق ، تبرد إلى صفر إلى خمس درجات مئوية مع الثلج.

يستغرق هذا عادة من 15 إلى 20 دقيقة. بعد ذلك ، أضف دوديسيل بنزين سلفونات الصوديوم إلى محلول الأنيلين في قارورة مستديرة القاع مع التقليب عند 600 دورة في الدقيقة. قم بإذابة بيرسلفات الأمونيوم في 20 مل من الماء وأضفه بالتنقيط على مدى 30 دقيقة لتجنب ارتفاع درجة حرارة التفاعل.

قم بإجراء التفاعل عند صفر إلى خمس درجات مئوية لمدة 24 ساعة. لاحظ أن خليط التفاعل يتحول في البداية إلى اللون الأبيض اللبني بعد 15 دقيقة ، ثم إلى اللون البني الداكن بعد ساعتين ، وأخيرا إلى اللون الأخضر الداكن بعد 24 ساعة. ثم اتركه يصل إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة أخرى.

قم بتصفية محلول PANI dodecylbenzenesulfonate الصوديوم باستخدام قمع بوشنر. امزج المرشح مع 80 مل من الكلوروفورم و 120 مل من الماء في قمع فصل. احتضان المحلول لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة ثم اجمع PANI الأخضر الداكن من قمع الفصل ، تاركا دوديسيل بنزين سلفونات الصوديوم غير المتفاعل و APS في المادة المطفية المائية.

بتخفيف محلول PANI 10 X بماء الكلوروفورم ثم اخلطي 200 ميكرولتر من PANI المخفف مع 6.4 ميكرومول من قليل النوكليوتيدات للحمض النووي عن طريق التأرجح اللطيف لمدة 15 دقيقة في أنبوب الطرد الدقيق. قم بتشعيع محلول PANI DNA ب 1200 ميكروجول لكل سنتيمتر مربع من الأشعة فوق البنفسجية في رابط متشابك لمدة دقيقتين. من الأهمية بمكان أن يقتصر التعرض للأشعة فوق البنفسجية على الكمية المشار إليها.

يؤدي التعرض المطول للأشعة فوق البنفسجية إلى الإضرار بالتغير الفلوري في PANI ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى التسرب التساهمي ل PANI والحمض النووي. مجمعات الحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 17 ، 000 × جم لمدة ست دقائق وغسلها بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات أو PBS. بعد التكوير مرة ثانية ، قم بإعادة التعليق في PBS.

أضف ثمانية ميكرولترات من قليل النوكليوتيدات التكميلية للحمض النووي 100 ميكرومولر أو الأحماض النووية المستهدفة إلى 200 ميكرولتر من مجمعات مسبار PAN. قم بإجراء التهجين عن طريق هز خليط المحلول لمدة 15 دقيقة عند 40 درجة مئوية. بعد تكوير مجمعات PANI عن طريق الطرد المركزي عند 17 ، 000 × جم لمدة ست دقائق ، اغسلها باستخدام PBS وأعد تعليقها في الماء.

أضف PANI من معالجات مختلفة إلى صفيحة دقيقة مكونة من 96 بئرا وقم بقياس تألق الانبعاث في نطاق 270 إلى 850 نانومتر عن طريق الإثارة عند 250 نانومتر. يجب ملاحظة ذروة انبعاث PANI حوالي 500 نانومتر. لإجراء قياس المجهر الفلوري للدوبلكس المغطى بالماء ، قم بإسقاط طبقة PANI على غطاء زجاجي من البورسليكات وتجفف عند 40 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.

أضف ثمانية ميكرولترات من مسبار 100 ميكرومولر على فيلم PANI المجفف ثم قم بإشعاعه بالأشعة فوق البنفسجية لمدة دقيقتين. بعد الإشعاع ، اغسل فيلم مسبار PANI باستخدام PBS وجففه عند 40 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. قم بإجراء التهجين لمدة 15 دقيقة عن طريق إضافة الأحماض النووية المستهدفة.

يمكن أن تكون هذه عينة بيولوجية أو قليل النوكليوتيد المستهدف الخاضع للرقابة. يتبع ذلك بغسل PBS. احصل على صور الفلورسنت بتكبير 40 × باستخدام مرشح تمرير بطول 500 نانومتر.

يظهر هنا التفاعل الكهروستاتيكي لمجسات PANI و DNA المعززة بالأشعة فوق البنفسجية. يؤدي تهجين الحمض النووي المستهدف إلى تكوين الازدواج ، مما يؤدي إلى تغيير التأكيد الهيكلي ، مما يؤدي إلى تفكك هدف المسبار عن سطح PANI. يوضح هذا الشكل التغير في مضان PANI في غياب أو وجود مسبار ، سواء في المحلول أو وسط الطلاء الصلب.

ترجع الزيادة في التألق إلى تدفق الإلكترون من الحمض النووي سالب الشحنة ، مما يزيد من كثافة إلكترون البوليمر. عند تهجين قليل النوكليوتيدات المستهدفة التكميلية ، تنفصل المجسات ، مما يؤدي إلى استعادة مضان الريحان. على العكس من ذلك ، فإن التهجين مع قليل النوكليوتيدات المستهدفة غير المتطابقة لا يؤدي إلى استعادة مضان الريحان.

الحداثة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تستخدم الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة للتفاعل الدقيق وهذا يساعدها في الواقع على التمييز بين التفاعل غير المحدد والضوء. بمجرد إتقانها ، قد تستغرق هذه التقنية ما يصل إلى ساعتين باستثناء وقت الحواس ووقت تجفيف الطلاء. أثناء تجربة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن الحمض النووي يذوب في الماء وأن الشاي الحمضي يغير في الواقع الخاصية الإلكترونية ل PANI.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لدى المشاهدين فهم جيد لكيفية تصنيع مادة البولي أنيلين المشتتة بالماء واستخدام خصائصه الفلورية للكشف عن الأحماض النووية. سيكونون قادرين على شل حركة الحمض النووي للمسبار وإجراء التهجين لاكتشاف الأهداف. من خلال العمل مع المونومر ، من المهم أن تتذكر أن هذا التوليف خطير ويجب أن يتم في غطاء مع معدات الحماية مثل نظارات السلامة والقفازات ومعاطف المختبر.