التحت خلوية تسجيلات التصحيح، المشبك من المجال Somatodendritic من سودائي الدوبامين العصبية

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب ، مثل كيف تساهم القنوات الأيونية الفردية ذات الجهد الكهربائي في وظائف خلية عصبية معينة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بتعيين وظيفة القنوات الأيونية على المستوى تحت الخلوي في الخلايا العصبية. ابدأ هذا الإجراء بوضع الدماغ على طبق بتري بطول 9 سم مع تغطية الجزء السفلي بطبقة من SiliGuard.

بعد ذلك ، أحط الدماغ بالسكروز المثلج. لتحضير شرائح إكليلية ، قم بعمل قطعتين لإزالة المخيخ والجزء المنقاري من الدماغ. ثم ضع غراء cyanoacrylate على صينية العينات ، وألصق كتلة الدماغ بالدرج بحيث يواجه الجزء المنقاري مرحلة التقطيع.

بعد ذلك ، ضع بضع قطرات من السكروز ACSF على الدماغ واغمر الدرج ببطء في غرفة التقطيع. بعد ذلك ، اضبط شفرة الحلاقة بزاوية 15 درجة بالرجوع إلى المستوى الأفقي. قطع شرائح الدماغ الإكليلية بحوالي 500 ميكرومتر في اتجاه الأنف القطني قبل الوصول إلى المادة السوداء.

ثم اضبط السماكة لقطع شرائح 300 ميكرومتر تحتوي على منطقة الاهتمام. افصل الشرائح عن كتلة الأنسجة بإبرة وفرة رفيعة جدا متصلة بحقنة موازية لحافة شفرة الحلاقة. بعد ذلك ، انقل الشرائح إلى غرفة الاحتياط على حرارة 34 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

في هذا الإجراء ، انقل شريحة دماغية إلى غرفة التسجيل. قم بتثبيت الشريحة في الجزء السفلي من غرفة التسجيل بحلقة بلاتينية ، وتأكد من أن الشريحة ذات نوعية جيدة مع سطح أملس ومستو. ثم حدد خلية عصبية بها تغصنات تمتد على مسافة طويلة في نفس المستوى ، وتأكد من إمكانية اتباع التغصنات ذات الأهمية إلى سوما محدد جيدا.

بعد ذلك ، املأ ماصة التصحيح بمحلول القطب. لتصحيح التغصنات في الوضع المتصل بالخلية ، حدد جزءا من التغصنات وركز عليه. اضغط إيجابيا على الماصة وخفضها باستخدام المعالج الدقيق.

ثم ضع الماصة بالقرب من الغشاء واضبط الضغط لإنشاء غمازة صغيرة. بعد ذلك، حرر الضغط على طرف الماصة وقم بتصحيح التغصن، مع التحكم في مقاومة الماصة. حاول الحصول على مقاومة مانعة للتسرب أكبر من غيغاأوم واحد ، في أحسن الأحوال بين ثلاثة وعشرة جيجا أوم ، للتسجيلات المرتبطة بالخلايا.

بعد ذلك ، اسحب الماصة بعيدا عن الغشاء ، بمقدار بضعة ميكرومتر ، لتجنب تشوه التغصنات. تمثل تيارات العمل التي تظهر هنا إمكانات الفعل التلقائي للخلايا العصبية السوداء. لقمع تيارات العمل ، قم بتطبيق حاصرات قنوات الكالسيوم والصوديوم على ACSF.

ثم قم بتطبيق خطوة جهد قدرها 90 مللي فولت ، من جهد احتجاز يبلغ صفر مللي فولت ، لاستحضار التيار الكاتيوني المنشط بفرط الاستقطاب. في نهاية التسجيل ، قم بتمزيق التصحيح لتحقيق وضع الخلية بالكامل. بعد ذلك ، اسحب الماصة الشجيرية ببطء وبلطف من الغشاء العصبي للحصول على رقعة خارجية للخارج.

للتسجيل من سوما المقابل في وضع الخلية بأكملها ، حدد موقع سوما التغصنات المقابلة. اخفض ماصة بمقاومة تتراوح بين خمسة إلى عشرة ميغا أوم بمحلول داخل الخلايا قائم على البوتاسيوم لجسم الخلية. ثم قم بتطبيق ضغط سلبي قصير على طرف الماصة لتمزق الغشاء من أجل تحقيق وضع الخلية بأكملها.

تحقق من هوية الخلايا العصبية في وضع المشبك الحالي عن طريق تطبيق خطوات طويلة للتيار المفرط وإزالة الاستقطاب ، والسماح للبيوالسيتين من الماصة بالانتشار على طول التشعبات. بعد 10 دقائق ، اسحب الماصة للحصول على رقعة خارجية للخارج. استخدم سلسلة من الحركات الأفقية الجانبية القصيرة لصالح الإغلاق الصحيح لغشاء الخلية، بمجرد أن تكون الماصة فوق الشريحة، للخروج تماما من غرفة التسجيل.

احتفظ بالشريحة في غرفة التسجيل لمدة 15 دقيقة إضافية في ACSF القياسي للسماح بتوازن البيويسيتين والخلايا العصبية المسجلة. ثم انقل الشريحة برفق إلى زجاجة زجاجية كهرمانية سعة 25 مليلتر تحتوي على ACSF قياسي للنسجة. في هذا الإجراء ، حدد موقع الخلايا العصبية المسماة بشكل دقيق تقريبا في الشريحة مع epiflourescence.

افحص بإيجاز الشجرة الشجيرية للخلايا العصبية وحدد موقع المحور العصبي والفقاعة المحورية باستخدام هدف 10X. بعد ذلك ، قم بالتبديل إلى المجهر متحد البؤر ، وحدد الصمام الثنائي الليزري 488 نانومتر لإثارة الخلايا العصبية المسماة. اتبع امتداد المحور العصبي والتشعبات في المحور Z ، وسجل الصور المتتالية من أجل الحصول على مكدس Z للخلية بأكملها.

اضبط دقة المحور Z واجمع الصور متحد البؤر للخلية بتكبير منخفض وعالي. في النهاية ، افتح ملف صورة الخلايا العصبية باستخدام برنامج تصوير. قارن صورة الإسقاط Z مع صورة IR-DGC بالعين لتحديد الموضع الدقيق لماصة التصحيح أثناء التسجيل الفيزيولوجي الكهربي.

تظهر هنا صورة IR-DGC لخلية عصبية من الدوبامين وماصة على التغصنات القريبة. يظهر التتبع الحالي قدرة تيارات تسرب EN استجابة لأمر جهد خمسة مللي فولت ، في تكوين متصل بالخلية ، مع مقاومة ختم تبلغ خمسة جيجا أوم. أدت خطوة الجهد المفرط الاستقطاب ، من إمكانات غشاء تبلغ صفر مللي فولت ، إلى تنشيط تيار كاتيوني ينشط ببطء بفرط الاستقطاب.

تم عكس التتبع الحالي وتزويده بوظيفة أسية واحدة ، مما يعطي ثابتا زمنيا قدره 632 مللي ثانية. فيما يلي استجابات الجهد للخلية بأكملها المسجلة سوما إلى نبضات تيار فرط وإزالة الاستقطاب في ثانية واحدة في وجود حاصرات تيار الصوديوم والكالسيوم ذات الجهد الكهربائي لإزالة إمكانات العمل أثناء التسجيل المتصل بالخلية. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في يوم واحد ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحصول على أنسجة سليمة وظروف تسجيل مستقرة. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل الكيمياء المناعية ، من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل هوية الخلايا العصبية المسجلة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الفيزيولوجيا العصبية لاستكشاف وظيفة خصائص ودور القنوات الأيونية ذات الجهد الكهربائي في الخلايا القابلة للاستثارة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تسجيل وفحص توزيع التيارات المتدفقة عبر القنوات الأيونية ذات الجهد الكهربائي في التشعبات.