باستخدام شعري الكهربائي لقياس الأحماض العضوية من الأنسجة النباتية: حالة اختبار فحص

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس مستويات الأحماض العضوية الموجودة في الأنسجة النباتية. ويمكن استخدام هذه الطريقة للإجابة على تساؤلات في الكيمياء الحيوية ووظائف الأعضاء النباتية، مثل تأثير المحفزات البيئية على نمو الجذور، وتطور المحاصيل، وجودة الأغذية أو المشروبات. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذه الطريقة في أن تحضير العينات يكون في حده الأدنى، وأن الطريقة ذات إنتاجية عالية، كما أن الفصل الكهربائي الشعري أكثر فعالية من حيث التكلفة مقارنة بمطياف الكتلة.

على الرغم من استخدام هذه الطريقة لتوضيح الاستجابات الفسيولوجية للنباتات، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً في علوم الغذاء وجودة الغذاء، حيث تؤثر الأحماض العضوية بشكل حاسم على النكهة والسلامة والاستقرار. للبدء، قم بتجميع عينات لاستخلاص الأحماض الكربوكسيلية قصيرة السلسلة (SCCA). قم بتحضير جرام واحد من بذور القهوة في كل مرة لضمان بقاء كمية كافية من العينة بعد المعالجة.

للحصول على حجم جسيمات موحد لتحقيق أقصى كفاءة لاستخلاص SCCA، قم أولاً بتبريد الهاون والمدقة مسبقاً باستخدام النيتروجين السائل. أضف العينة إلى حجم صغير من النيتروجين السائل في الهاون. وباستخدام مغرفة، أضف كمية كافية من النيتروجين السائل إلى الهاون لغمر العينة بالكامل.

أضف العينات التي يصعب طحنها، مثل بذور البن الخام، إلى النيتروجين السائل. اتركها تتجمد لمدة تتراوح من 10 إلى 30 ثانية قبل الطحن. قم بتفتيت النسيج إلى قطع أصغر باستخدام حركة سحق عمودية.

بعد ذلك، أكمل عملية طحن الأنسجة باستخدام حركة طحن دائرية. كرر خطوتي التجميد والطحن مرتين إضافيتين بحيث يتم طحن العينات ثلاث مرات إجمالاً. وعادةً ما تؤدي ثلاث جولات متتالية من الطحن إلى تحويل العينات إلى مسحوق بقوام يشبه الدقيق.

انقل المسحوق إلى قوارير زجاجية أو أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 ml. ابدأ عمليات المعالجة اللاحقة فوراً بعد الطحن، أو احفظ العينات عند درجة حرارة 80 درجة مئوية حتى تصبح العينات جاهزة للاستخلاص. جهز معايير أصيلة لـ SCCAs المستهدفة لتحضير محاليل معيارية خارجية وداخلية لاستخدامها في تحديد تركيزات SCCA.

بالنسبة لعينات القهوة، يتم تضمين حمض الستريك، وحمض الماليك، وحمض الأسيتيك، وحمض اللاكتيك كأحماض مستهدفة، وحمض الأديبك كمعيار داخلي. يتم تحضير محلول مخزون بتركيز 10 mg/mL عن طريق إضافة 100 mg من المعيار إلى دورق قياسي سعة 10 mL. يُملأ الدورق القياسي حتى علامة 10 mL بالماء عالي النقاوة لإذابة الحمض.

انقل كل محلول مخزون إلى أنبوب زجاجي نظيف سعة 15 milliliter، مزود بغطاء مبطن بمادة البوليتيترافلوروإيثيلين، وأغلقه باستخدام غشاء البارافين البلاستيكي. يمكن تخزين المحاليل المخزونة في أنابيب محكمة الإغلاق عند درجة حرارة أربعة degrees Celsius لمدة أسبوع واحد. قم بتحضير 50 milliliters من محلول استخلاص SCCA عن طريق تخفيف المحلول المخزون للمعيار الداخلي ليصل تركيزه إلى 0.05 milligrams per milliliter في ماء فائق النقاء.

قم بذلك عن طريق إضافة 250 µL من المحلول المخزون للمعيار الداخلي إلى 49.75 mL من الماء. بعد ذلك، قم بتحضير عينات منحنى المعايرة لـ SCCAs المستهدفة. استخدم خمس نقاط كحد أدنى على الأقل بتركيزات تقع ضمن نطاق الاستجابة الخطية وتغطي تركيزات SCCA المتوقعة في العينات.

قم بتخفيف كل SCCA إلى التركيز المحدد في أنابيب طرد مركزي دقيقة جديدة باستخدام ماء فائق النقاء حتى يصل الحجم إلى 1 ml. تأكد من أن كل نقطة تركيز تحتوي على جميع المعايير الحمضية الأربعة والمعيار الداخلي بالتركيز الصحيح. أخرج العينات المراد استخلاصها من مكان التخزين، وضعها على الثلج.

زن 100 milligram من العينة من أجل استخلاص SCCA. قم بقياس كمية من العينة تكون أقرب ما يمكن من الكتلة المستهدفة، وذلك لتقليل التباين. بعد وزن كل عينة، انقل النسيج إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف سعة 1.5 milliliter.

تتبع كتلة كل عينة تم قياسها، حيث سيتم تطبيع كميات SCCAs المكتشفة باستخدام كتلة العينة. بعد وزن جميع العينات، أضف 1 mL من محلول الاستخلاص إلى كل أنبوب من أنابيب العينات. حافظ على ثبات نسبة محلول الاستخلاص إلى كتلة النسيج في جميع عمليات الاستخلاص.

امزج جيداً باستخدام جهاز الـ vortex لمدة 10 seconds. اترك العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. وخلال هذه الساعة، امزج كل أنبوب كل 15 minutes باستخدام جهاز الـ vortex لمدة 10 seconds.

بعد مرور ساعة واحدة من الاستخلاص، اخلط العينات للمرة الأخيرة وانقل أنابيب العينات إلى جهاز طرد مركزي دقيق. قم بتركيز العينات عند درجة حرارة 4 °C، وبقوة 10,000 ×g لمدة 10 دقائق، لترسيب المواد الصلبة. ولترشيح العينات، قم بتجهيز مرشحات قرصية مثبتة على محاقن، مع التأكد من تركيب كل مرشح بشكل صحيح في المحقنة.

قم بتجهيز سرنجة واحدة مزودة بمرشح قرصي لكل عينة سيتم تحليلها، بما في ذلك عينات منحنى القياس المعياري. قم بترشيح السوائل الطافية مباشرة في أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف. بعد الترشيح، أغلق الأنبوب الذي يحتوي على الراشح، وتخلص من جهاز ترشيح السرنجة.

انقل 1 mL من العينة إلى كل أنبوب تحليل الفصل الكهربائي الشعيري (CE)، مع الحرص على تجنب تناثر العينة على عنق الأنبوب. بعد نقل العينة، ضع غطاء CE على كل أنبوب. قم بإعداد تشغيل كشف SCCA كما هو موضح في البروتوكول النصي.

قم بتحميل القوارير التي تحتوي على نقاط منحنى القياسي والقوارير التي تحتوي على العينات المراد تحليلها في صينية إدخال العينات، كما هو موضح في تعليمات الشركة المصنعة. دوّن موقع كل قارورة لبرمجة جهاز السحب الآلي للعينات. بعد إجراء عملية التهيئة كما هو موضح في البروتوكول النصي، ابدأ في عملية فصل العينات عن طريق فتح قائمة التحكم (Control) في البرنامج، واختيار تشغيل التسلسل (Run Sequence).

راقب مصفوفة الثنائي الضوئي، أو صواني PDA، لضمان الفصل الصحيح. لاحظ المخطط الأول وتأكد من أن له خط أساس مسطح، وأنه يفصل بدقة قمم الأحماض الفردية. لدمج قمم العينات، افتح الملف الأول واضبط خطوات التكامل التلقائي لاستبعاد الدقائق الثلاث الأولى من عملية التشغيل.

في القائمة نفسها، اضبط معايير اختيار القمم على حد أدنى لعرض القمة يبلغ 50 وحدة، ومساحة قمة تبلغ 100 وحدة، وذلك لتوفير مستوى عالٍ متوسط من الانتقائية، مما يفصل قمم الأحماض عن ضوضاء الخلفية في المخطط. قم بإجراء تحليل البيانات كما هو موضح في البروتوكول النصي. يظهر هنا مقارنة لمخططات PDA تسلط الضوء على عينة محملة بشكل زائد.

مع زيادة تركيز المادة التحليلية، قد يبدأ شكل القمم الفردية في أن يصبح غير متماثل. فعند تركيز 0.05 milligrams per milliliter، يظهر حمض الأسيتيك قمة متماثلة ثنائياً ومحددة جيداً. ومع زيادة تركيز حمض الأسيتيك إلى 0.07 أو 0.10 milligrams per milliliter، تصبح القمة غير متماثلة، ويتشكل ذيل للقمة.

يعد تذييل القمة هذا مؤشراً جيداً على وجود حمل زائد في العينة. تُعرض هنا آثار PDA نموذجية توضح الأحماض العضوية في عينات القهوة الخضراء. وقد تم تخفيف عينات القهوة الخضراء بنسبة 1:10 قبل تحميلها في قوارير CE.

تشمل الأحماض محل الاهتمام حمض الأسيتيك، وحمض الستريك، وحمض اللاكتيك، وحمض الماليك، والمعيار الداخلي، حمض الأديبيك. وأثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر طحن العينات للوصول إلى قوام متجانس، وسحب العينات بدقة باستخدام الماصة، وذلك لزيادة إمكانية تكرار النتائج وتقليل الخطأ التجريبي إلى أدنى حد. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقدير كمية الأحماض العضوية من عينات النباتات باستخدام الفصل الكهربائي الشعري، أو CE. كما يجب أن تكون قادراً على طحن عينات النباتات، واستخلاص الأحماض العضوية، وتحضير مستخلصات النباتات لإجراء تحليل CE اللاحق.