تحديد الركيزة الخصوصيات لالليباز وفسفوليباز المرشحين

الهدف العام من هذا الإجراء هو تسريع الكشف عن الركائز الفسيولوجية للليباز والفوسوفيوليباز المحتملة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الحشرات ، مثل كيف تساهم الفوسفوليباز في إعادة تشكيل الدهون في الأغشية البيولوجية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن إجراء تحسين النشاط الأنزيمي والبحث عن الركيزة الطبيعية للإنزيم بشكل مستقل.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لخصوصية الركيزة للليباز البكتيري والفوسفوليباز ، إلا أنه يمكن أيضا تعديلها لدراسة الهيدرولاز لأي كائنات نموذجية أخرى. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما بحثنا عن نشاط إنزيمي يمكن أن يؤدي إلى تحلل الغشاء الجوهري للدهون فوسفاتيديل كولين inorhizobium meliloti. لتحضير مستخلصات البروتين الخالية من الخلايا ، قم بإذابة معلقات الخلايا البكتيرية وتخزينها على الثلج.

بعد ذلك ، قم بتمرير معلقات الخلية ثلاث مرات عبر خلية ضغط بارد بمعدل 20،000 رطل لكل بوصة مربعة. قم بإزالة الخلايا داخل اللباقة وحطام الخلية عن طريق الطرد المركزي عند 5 ، 000 مرة جم لمدة 30 دقيقة ، عند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، قم بإعداد حصص من 100 و 500 ميكرولتر من المادة الطافية للتحليل اللاحق.

قم بإعداد مقايسة الإنزيم المحسنة مسبقا باستخدام مخططات سحب العينات المجدولة في بروتوكول النص. للحصول على تغطية أولية لأنشطة الإنزيم المميزة ، استخدم ركائز اصطناعية تنتج منتجا ملونا عند التحلل المائي ، مثل مشتقات بارا نيتروفينول أو PNP. اتبع المسار الزمني لزيادة الامتصاص عند 405 نانومتر ، بسبب تكوين PNP في مقياس الطيف الضوئي عند 30 درجة مئوية خلال فترة خمس دقائق.

أخيرا ، قم بإجراء العمليات الحسابية كما هو موضح في بروتوكول النص. لوضع العلامات الراديوية للدهون ، قم بإعداد استزراع مسبق بين عشية وضحاها لكائن حي ذي أهمية في خمسة ملليلتر من وسط الثقافة المطلوب وتنمو عند 30 درجة مئوية. من مرحلة ما قبل الاستزراع، قم بتلقيح 20 ملم من الوسط الطازج في قارورة استزراع 100 ملم، للحصول على كثافة بصرية أولية عند 620 نانومتر من 0.3 للثقافة.

بعد ذلك ، قم بنقل كمية ملليلتر واحد من الثقافة إلى أنبوب دائري دائري من البوليسترين معقم سعة 14 مليلتر في ظل ظروف معقمة. أضف ميكروكوري واحد من 114 درجة مئوية من الأسيتات إلى ثقافة المليلتر الواحد. ثم احتضان المزرعة السائلة تحت التحريض عند 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

في نهاية فترة الحضانة ، انقل المزرعة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مليلتر وجهاز طرد مركزي عند 12،000 مرة جم في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. أعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من الماء. في هذه المرحلة ، قم بتخزين تعليق الخلية عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر أو استمر على الفور في استخراج الدهون القطبية.

لإجراء استخراج الدهون القطبية ، أضف 375 ميكرولترا من اثنين إلى واحد من الميثانول إلى محلول الكلوروفورم إلى 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا المائية. دوامة العينة لمدة 30 ثانية قبل احتضانها لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، جهاز الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 12 ، 000 مرة في درجة حرارة الغرفة.

ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل. بعد ذلك ، أضف 125 ميكرولترا من الكلوروفورم و 125 ميكرولترا من الماء إلى المادة الطافية. بعد الدوامة لمدة 30 ثانية ، قم بالطرد المركزي للعينة لمدة دقيقة واحدة عند 12 ، 000 مرة جم في درجة حرارة الغرفة.

انقل مرحلة الكلوروفورم السفلية إلى أنبوب جديد. ثم جفف المحلول بتيار من غاز النيتروجين. قم بإذابة الدهون المجففة في 100 ميكرولتر من محلول الكلوروفورم إلى الميثانول.

لفصل الدهون القطبية المحايدة عن طريق كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة ، قم بتطبيق ثلاثة أجزاء ميكرولتر من عينات الدهون ، على صفائح ألومنيوم هلام السيليكا ذات الطبقة الرقيقة عالية الأداء ، بدءا من سنتيمترين من حواف اللوحة. إذا تم تحليل عينات متعددة في كروماتوغرافيا أحادية البعد ، فاحتفظ بمسافة لا تقل عن 1.5 سم بين نقاط تطبيق العينة المختلفة. انقل المرحلة المتنقلة إلى غرفة تطوير TLC ، مغلفة داخليا بورق كروماتوغرافيا.

غطيها بطبق زجاجي للسماح للغرفة بالتشبع لمدة 30 دقيقة. انقل صفائح الألمنيوم HPTLC Silica Gel مع عينات الدهون المجففة إلى الغرفة. اترك اللوحة تتطور لمدة 30 دقيقة في غرفة مغلقة قبل إزالة اللوحة.

ثم اترك المذيبات تجف في غطاء التدفق لمدة ساعتين. بمجرد أن تجف ورقة TLC المطورة ، قم باحتضانها بشاشة تلألؤ قابلة للمحاكاة الضوئية في شريط مغلق لمدة ثلاثة أيام. بعد ذلك ، قم بتعريض الشاشة المحتضنة لماسح ضوئي PSL واحصل على صورة افتراضية للدهون المنفصلة المسماة بالراديو.

لتحديد نشاط ثنائي الجلسرين ، أو DAG ، الليباز ، أضف أولا 5 ، 000 ألف دورة في المليون من 14 DAG المسمى C إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. أضف أيضا محلول Triton X-100 إلى الأنبوب واخلطه عن طريق الدوامة. جفف المحلول تحت تيار من النيتروجين.

للحصول على فحص نهائي 100 ميكرولتر ، أضف مخزن Tris-HCl المؤقت ، ومحلول كلوريد الصوديوم ، والماء المقطر ثنائي المقطر. دوامة لمدة خمس ثوان. ابدأ التفاعل بإضافة خمسة ميكرولترات من الإنزيم إلى المحلول.

احتضان المحلول عند 30 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. أوقف التفاعل بإضافة 250 ميكرولتر من الميثانول و 125 ميكرولتر من الكلوروفورم ، قبل استخراج الدهون كما هو موضح سابقا في هذا الفيديو. تابع تحليل الدهون القطبية المحايدة بواسطة 1DTLC وتصوير PSL اللاحق كما كان من قبل.

على الرغم من أن الفوسوفوليباز المتوقع SMc01003 يظهر نشاطا مع استرات أسيل بارا نيتروفينول الاصطناعية ، إلا أن النشاط هو ضعف أو ثلاثة أضعاف نشاط الخلفية الموجود في المستخلصات الخالية من الخلايا من الإشريكية القولونية ، حيث لم يتم التعبير عن أي جين غريب. يشير هذا إلى أن استرات أسيل بارا نيتروفينيل لا يبدو أنها ركائز جيدة ل SMc01003. في حين أن المستخلصات الخالية من الخلايا من الإشريكية القولونية لا يمكن أن تحلل ثنائي الجلسرين ، فإن مستخلصات السلالات التي تم فيها التعبير عن الفوسفوليباز المتوقع ، SMc01003 ، تسببت في تدهور دياسيل الجلسرين.

على الرغم من أنه كان من المتوقع أن يكون SMc01003 فوسفوليباز ، إلا أنه في الواقع ثنائي الجلسرين ليباز الذي يحلل دياسيل الجلسرين إلى أحادي الجلسرين وحمض دهني واحد. ثم يحلل أحادي الجلسرين إلى الجلسرين وحمض دهني آخر. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون أسابيع قليلة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحسين أنشطة الإنزيم للليباز والفوسفوليباز ، وكيفية الاستمرار في البحث عن ركائزها الفسيولوجية. تتمثل إحدى المزايا الحاسمة لهذا الإجراء في أنه يمكن فصل تحسين نشاط الإنزيم عن البحث عن ركيزة الإنزيم الطبيعي. لا تنس أن العمل مع المذيبات العضوية أو المواد المشعة يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات المطلوبة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.