في دراسة فيفو من تفاعل الانسان غشائي-خلية حوطية باستخدام مصفوفة جل التوصيل الفحص في الماوس

الهدف العام من مقايسة هلام المصفوفة هذه في الجسم الحي هو استقصاء التفاعل بين الخلايا البطانية والطفيليات. صُممت مقايسة ماتريجيل هذه لمساعدة الباحثين في دراسة الخطوات الرئيسية في تكوين الأوعية الدموية. كما ستسمح بتحديد مسارات التأشير المسؤولة عن الخطوات الرئيسية في تشكل الأوعية الدموية، بالإضافة إلى الجينات التي قد يؤدي خللها الوظيفي إلى اضطرابات وعائية وانحرافات أخرى في عملية تكوين الأوعية الدموية.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تتيح لنا دراسة تشكل الأوعية الدموية داخل الجسم الحي (in-vivo) بمشاركة كل من الخلايا البطانية وخلايا الدعم المتمثلة في الخلايا الحولية. للبدء، يتم استزراع الخلايا البطانية البشرية وخلايا الطفيليات في أطباق قطرها 100 مليمتر مع 10 ملليلتر من الأوساط الغذائية المناسبة. يتم تغيير الأوساط الغذائية كل يومين إلى ثلاثة أيام حتى تصل الخلايا إلى نسبة تلاحم 80%.

من أجل تحضير محلول هلام المصفوفة (matrix gel) لخلطه مع الخلايا، قم بإذابة مخزون من هلام المصفوفة طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. ثم قم بتجزئته إلى حصص حجم كل منها 1.5 mL للتخزين طويل الأمد عند درجة حرارة -20 °C، أو عند درجة حرارة 4 °C لمدة تصل إلى أسبوعين. ستتطلب كل سدادة تجريبية 200 µL من هلام المصفوفة.

وبذلك، يمكن لأنبوب مخزون واحد أن يمد ست سدادات بزيادة قدرها 25%. قم بتحضير كل حصة مطلوبة للاستخدام عن طريق إضافة 15 µL من مخزون beta-FGF بتركيز 100x بعد إذابته. امزج beta-FGF في المحلول عن طريق السحب والضخ بالماصة، ثم حضنه على الثلج لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل إضافة الخلايا.

في هذه المرحلة، قم بتبريد بعض محاقن الأنسولين سعة 1cc وبقياس 28-gauge لاستخدامها في عمليات الحقن. ولجمع الخلايا من أطباق الزرع، قم بإزالة الوسط الغذائي وغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS. بعد إزالة PBS، أضف ملليلتر واحد من محلول التربسين وأعد الأطباق إلى الحاضنة لمدة دقيقة واحدة.

بعد ذلك، يتم سحب مليليترين من وسط الزرع باستخدام الماصة وإضافتهما فوق الأطباق لفصل الخلايا، ثم يُجمع الوسط في أنبوب سعة 15 مليليتر. الآن، يتم فحص تركيز العينات المجمعة باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer). ثم تُحضّر حصص موزعة من الخلايا في أنابيب سعة 15 مليليتر.

يُستخدم هنا مزيج من مليون خلية بطانية و200,000 طفيلي للمجموعة التجريبية. بعد ذلك، تُطرد حصص الخلايا مركزياً عند 400g لمدة خمس دقائق. ثم يُضاف الحجم المحسوب من الماتريكس جل (matrix gel) إلى كتلة الخلايا المترسبة، ويُخلط عن طريق السحب والضخ اللطيف بالماصة لتجنب تكون رغوة، حيث لا يمكن حقن الفقاعات الهوائية.

احتفظ الآن بالتحضيرات على الثلج حتى تصبح الفئران جاهزة للحقن. بعد تخدير الفأر باستخدام isoflurane، والتأكد من حالة التخدير عن طريق قرص إصبع القدم، قم بتوصيل الفأر بنظام التنفس غير المرتجع الذي يمد بالـ isoflurane وضعه على وسادة التدفئة، بحيث يكون الجانب البطني لأسفل. الآن قم بإزالة الشعر من مساحة تقارب سنتيمتر مربع واحد من كلا المنطقتين الخلفيتين الجانبيتين.

بعد ذلك، امسح الجلد المكشوف جيداً باستخدام كحول 70%. تالياً، يتم تحميل واحد مللي لتر من محلول الخلايا المُحضّر في حقنة مبردة، وهي كمية تكفي لأربع سدادات. لإجراء الحقن، ارفع الجلد الخلفي لتحديد مكان الحيز تحت الجلد.

ثم احقن 200 µL ببطء وبشكل متساوٍ في الفراغ تحت الجلد خلف القفص الصدري، واسحب الإبرة ببطء لمنع التسرب. ستتكون تورمة في موقع الحقن بعد الانتهاء. امسح الموقع بالكحول، ثم حدد التورمة بقلم تحديد دائم لسهولة العثور عليها لاحقاً.

بعد ذلك، كرر إجراء الحقن على الجانب الآخر من الفأر. تأكد من حقن جميع الخلايا في غضون ثلاث دقائق وإلا ستبدأ في الالتصاق بالسرنجة. وتعد خطوة الحقن بالغة الأهمية لضمان تشكل سدادة هلام المصفوفة بين طبقتي الجلد والعضلات، بحيث تحافظ السدادة على شكل جيد ولا تصبح منتشرة.

قبل المضي قدماً في حقن الفأر التالي، اترك الفأر المحقون على وسادة التسخين لمدة دقيقة لإعطاء المصفوفة وقتاً لتتجلط. بعد القتل الرحيم، ضع الفأر على منصة التشريح. وبعد إزالة أي شعر نما مجدداً من موقع الحقن، حدد خطوط العلامات التي توضح موقع السدادة.

بعد ذلك، وباستخدام مقص جراحي دقيق، يتم إجراء شق على طول الحدود المحددة للسدادة، بشكل عمودي على الجلد وصولاً إلى العضلة الموجودة تحته. يتم القص بعناية حول محيط الحدود المحددة. ثم تُزال السدادة مع الحفاظ عليها محصورة بين طبقتي الجلد والعضلات.

اشطف السدادة فوراً في بيكر صغير يحتوي على PBS لإزالة الدم. بعد ذلك، ضع السدادة بالكامل في أنبوب سعة 50 milliliter يحتوي على 25 milliliters من 4%paraformaldehyde. اتركها للتثبيت في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة دون أي رج.

في اليوم التالي، يتم نقل السدادات إلى 25 ملليلتر من الإيثانول بتركيز 70% لمدة 24 ساعة. بعد ذلك، يتم البدء في عملية الطمر بالشمع (paraffin embedding). وتظهر مقاطع السدادات التي تحتوي على خلايا بطانية فقط أن بعض الأوعية الدموية لا يتم ترويتها بدم المضيف بعد 14 يوماً داخل الجسم (in-vivo).

على النقيض من ذلك، تُظهر السدادات التي تحتوي على كل من الخلايا البطانية والطفيليات العديد من الأوعية الدموية المروية بعد 14 يوماً داخل الجسم الحي. تحتوي هذه السدادات على خلايا إيجابية لصبغة أكتين العضلات الملساء، والتي تظهر باللون الأحمر، وتكون مجاورة مباشرة للخلايا البطانية الإيجابية لـ CD31، والتي تظهر باللون الأخضر. وبناءً على ذلك، قد تلعب الطفيليات دوراً جوهرياً في تكوين الأوعية الدموية الناشئة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية تطبيق هذه التقنية القوية في الجسم الحي لدراسة تكوين الأوعية الدموية المستخدمة في أنواع متعددة من الخلايا. ستمهد هذه التقنية الطريق للباحثين لاستكشاف مواضيع متنوعة في بيولوجيا الأوعية الدموية في نماذج الفئران. وباتباع هذا الإجراء، يمكن أيضاً إجراء طرق أخرى، مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (quantitative PCR)، واللطخة المناعية لبروتينات ويسترن (Western immunoblotting)، للإجابة على أسئلة إضافية مثل التغيرات في التعبير الجيني والبروتيوميات.

ستسمح هذه التقنية القوية للباحث بدراسة كيفية تفاعل الخلايا البطانية والطفيليات داخل الجسم الحي أثناء تكوين الأوعية الدموية، وهي خطوة أساسية في عملية تكوين الأوعية الدموية. كما ستتيح هذه التقنية القوية للباحث دراسة التفاعلات الأخرى بين الخلايا ذات الصلة بفهم الأمراض الوعائية، مثل ارتفاع ضغط الدم الرئوي، وغيرها.