في دراسة فيفو من تفاعل الانسان غشائي-خلية حوطية باستخدام مصفوفة جل التوصيل الفحص في الماوس

الهدف العام من اختبار هلام المصفوفة في الجسم الحي هو التحقيق في تفاعل الخلايا البطانية مع الطفيليات. تم تصميم اختبار matrigel هذا لمساعدة الباحثين على دراسة الخطوات الرئيسية في الذكورة. كما سيسمح بتحديد مسارات الإشارات المسؤولة عن الخطوات الرئيسية في تكوين الأوعية الدموية بالإضافة إلى الجينات التي يمكن أن تؤدي إلى اضطرابات الأوعية الدموية وغيرها من الانحرافات في الذكورة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح لنا بدراسة تكوين الأوعية الدموية في الجسم الحي التي تشمل كل من الخلايا البطانية والخلايا الداعمة لها ، الحضجة. للبدء ، قم بزراعة مزارع الخلايا البطانية والطفيلية البشرية على ألواح 100 ملم مع 10 ملليلتر من الوسائط المناسبة. قم بتغيير الوسائط كل يومين إلى ثلاثة أيام حتى تصل الخلايا إلى 80٪ من التقاء.

من أجل تحضير محلول هلام المصفوفة للاختلاط مع الخلايا ، قم بإذابة مخزون من هلام المصفوفة طوال الليل عند أربع درجات مئوية. ثم قم بعمل 1.5 مليلتر من الحصص للتخزين عند سالب 20 درجة مئوية على المدى الطويل ، أو عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين. سيتطلب كل قابس تجريبي 200 ميكرولتر من هلام المصفوفة.

لذلك يمكن لأنبوب واحد مخزن توفير ستة سدادات بفائض بنسبة 25٪. قم بإعداد كل حصة مطلوبة للاستخدام عن طريق إضافة 15 ميكرولترا من مخزون بيتا FGF المذاب 100x. امزج بيتا FGF في محلول عن طريق سحب العينة ، ثم احتضنه على الجليد لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل إضافة الخلايا.

في هذه المرحلة ، قم بتبريد بعض محاقن الأنسولين عيار 28 سم مكعب للحقن. لجمع الخلايا من ألواح الثقافة ، قم بإزالة الوسائط وغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS. بعد إزالة PBS ، أضف ملليلترا واحدا من محلول التربسين وأعد الألواح إلى الحاضنة لمدة دقيقة واحدة.

بعد ذلك ، قم بسحب ملليلترين من وسائط الثقافة فوق الألواح لفصل الخلايا وتجميع الوسط في أنبوب سعة 15 ملليلترا. الآن ، تحقق من تركيز المجموعات باستخدام مقياس كثافة الدم. ثم قم بإعداد حصص من الخلايا في أنابيب سعة 15 ملليلترا.

استخدام مزيج من مليون خلية بطانية و 200،000 طفيلي هنا للمجموعة التجريبية. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلية عند 400 جرام لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، أضف الحجم المحسوب من هلام المصفوفة إلى حبيبات الخلية ، واخلطها مع ماصة لطيفة حتى لا يتم عمل رغوة ، حيث لا يمكن حقن فقاعات الهواء.

الآن احتفظ بالمستحضرات على الجليد حتى تصبح الفئران جاهزة للحقن. بعد تخدير الفأر بالأيزوفلوران ، وتأكيد حالة التخدير بقرصة إصبع القدم ، قم بتوصيل الماوس بنظام عدم إعادة التنفس الذي يزود الأيزوفلوران وضعه على وسادة التدفئة ، الجانب البطني لأسفل. الآن قم بإزالة حوالي سنتيمتر مربع من الشعر من كلتا المنطقتين الخلفيتين الجانبيتين.

ثم امسح الجلد المكشوف باستخدام 70٪ كحول. بعد ذلك ، قم بتحميل مليلتر واحد من محلول الخلية المحضر في حقنة مبردة ، وهو ما يكفي لأربعة مقابس. لإجراء حقن ، ارفع الجلد الخلفي لتحديد المساحة تحت الجلد.

ثم قم بحقن 200 ميكرولتر ببطء بالتساوي في المساحة الخلفية تحت الجلد للقفص الصدري ، وقم بإزالة الإبرة ببطء لمنع التسرب. بعد الحقن ، سوف يتشكل نتوء في الموقع. امسح الموقع بالكحول ، ثم حدد النتوء بعلامة دائمة حتى يمكن العثور عليه لاحقا.

ثم كرر إجراء الحقن على الجانب الآخر من الماوس. تأكد من حقن جميع الخلايا في غضون ثلاث دقائق وإلا ستبدأ في الالتصاق بالمحقنة. تعد خطوة الحقن أمرا بالغ الأهمية للقيام بعمل جيد للتأكد من أن سدادة جل المصفوفة ستتشكل بين طبقات الجلد والعضلات بحيث يحافظ القابس على شكل جيد ولا يصبح منتشرا.

قبل الشروع في حقن الماوس التالي ، اترك الماوس المحقون يبقى على وسادة الحرارة لمدة دقيقة لمنح المصفوفة وقتا للهلام. بعد القتل الرحيم ، قم بإعداد الماوس في مرحلة التشغيل. بعد إزالة أي شعر متجدد من موقع الحقن ، ابحث عن خطوط العلامة التي تحدد موقع السدادة.

بعد ذلك ، باستخدام مقص جراحي دقيق ، قم بعمل شق على طول الحدود المحددة للسدادة ، عموديا على الجلد وعبر العضلات تحتها. قطع بعناية حول محيط الحدود المحددة. ثم قم بإزالة السدادة ، واحتفظ بها محصورة بين طبقات الجلد والعضلات.

اشطف السدادة على الفور في كوب صغير من PBS لإزالة الدم. بعد ذلك ، ضع القابس بالكامل في أنبوب سعة 50 مليلتر مع 25 مل من 4٪ بارافورمالدهايد. اتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة دون أي تحريض.

في اليوم التالي ، انقل المقابس إلى 25 مل من 70٪ من الإيثانول لمدة 24 ساعة. ثم تابع تضمين البارافين. تظهر أقسام المقابس التي تحتوي على الخلايا البطانية فقط أن بعض الأوعية لا تتسرب بدم المضيف بعد 14 يوما في الجسم الحي.

على النقيض من ذلك ، تعرض المقابس التي تحتوي على كل من الخلايا البطانية والطفيليات العديد من الأوعية المنفخة بعد 14 يوما في الجسم الحي. تحتوي هذه السدادات على خلايا إيجابية لتلوين الأكتين في العضلات الملساء ، والتي تظهر باللون الأحمر ، بجوار الخلايا البطانية الإيجابية CD31 مباشرة ، والتي تظهر باللون الأخضر. لذلك ، قد تلعب الطفيليات دورا كبيرا في تكوين الأوعية الدموية الناشئة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تطبيق هذه التقنية القوية في الجسم الحي لدراسة تكوين الأوعية الدموية المستخدمة في أنواع متعددة من الخلايا. ستمهد هذه التقنية الطريق للباحثين لاستكشاف مواضيع مختلفة لبيولوجيا الأوعية الدموية في نماذج الفئران. باتباع هذا الإجراء ، يمكن أيضا تشغيل طرق أخرى ، مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي ، والنشاف المناعي الغربي للإجابة على أسئلة إضافية مثل التغييرات في التعبير الجيني والبروتينات.

ستسمح هذه التقنية القوية للباحث بدراسة كيفية تفاعل الخلايا البطانية والطفيليات أثناء تكوين الأوعية الدموية في الجسم الحي. وهي خطوة أساسية في تكوين الذكورة. ستسمح هذه التقنية القوية أيضا للمحقق بدراسة التفاعلات الخلوية الأخرى ذات الصلة بفهم أمراض الأوعية الدموية مثل ارتفاع ضغط الدم الرئوي وغيرها.