تطبيق الحواجز غير نفاذ جنبا إلى جنب مع المرشح عامل الخرز غارقة لدراسة إشارات الاستقرائي في الفرخ

الهدف من هذا التدخل الجراحي هو توضيح آليات تحفيز الأطراف في جنين الدجاج عن طريق منع جزيئات الإشارة من الانتشار من الأنسجة الإنسية إلى الخلايا الموجودة في ميزوديرم الصفيحة الجانبية ودراسة تأثير ذلك على التعبير الجيني. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في علم الأحياء النمائي، مثل: ما هي الإشارات التحفيزية التي تتحكم في بدء تكوين برعم الطرف. تكمن ميزة هذه التقنية في أن جنين الدجاج يسهل الوصول إليه لإجراء التلاعب الجراحي وهو قوي للغاية، بالإضافة إلى أن برعم الطرف المقابل غير المُجرى له العملية يعمل كعنصر تحكم داخلي مفيد جدًا.

ستقوم سوزان وايلد بشرح الإجراء. للبدء، قص قطعة مربعة بطول 1 cm من رقاقة ألومنيوم بسمك 0.013 mm وعقمها بمسحها بـ 70%ethanol. بعد ذلك، ضع المربع في طبق بتري بلاستيكي معقم بقطر 6 cm.

لمنع الالتصاق الاستاتيكي، تخلص من الغطاء واصنع غطاءً جديداً للطبق من نفس الرقاقة. بعد ذلك، ضع طبق بتري فوق مقياس المسرح (stage graticule) تحت مجهر ثنائي العينية مضبوط على تكبير 1.6x. استخدم مشرطاً صغيراً بشفرة رقم 15 لقص شرائح من الرقاقة بعرض 1.3 mm وطول 2 mm.

افصل شرائط القصدير باستخدام زوجين من ملاقط الساعات مقاس 4. بعد ذلك، قم بثني مركز حاجز القصدير بزاوية قائمة بحيث يشبه المفصلة. قم بمحاذاة الحواجز في مركز طبق بتري بحيث يكون أحد الجانبين مسطحاً مقابل الطبق والجانب الآخر متجهاً للأعلى خارج الطبق، وقم بتجهيز 20 حاجزاً أو أكثر قبل يوم العملية.

ضع غطاء القصدير فوق الطبق واحفظ الحواجز في مكان لا تتعرض فيه للإزعاج. أثناء وضع البيضة على جانبها، أمسك زوجاً من الملاقط القوية من النوع AA بإحكام واستخدم حركة طعن مدروسة لثقب الطرف غير المدبب للبيضة الذي يحتوي على الكيس الهوائي مع تثبيت البيضة باليد الأخرى. تأكد من تمزق غشاء القشرة الداخلي.

بعد ذلك، أمسك البيضة بكلتا يديك وأدرها بمقدار 180 درجة على طول محورها الأفقي. ثم خذ قطعة من الشريط اللاصق الشفاف، بمساحة 5 cm مربعة تقريباً، وألصقها بإحكام فوق السطح العلوي للبيضة لمنع تفتت قشرة البيضة فوق الجنين عند فتحها. استخدم مقصاً منحنياً لكسر القشرة والأغشية الخلوية الداخلية المرتبطة بها بلطف في مركز الجزء العلوي من البيضة.

اصنع ثقباً صغيراً جداً باستخدام أحد شفرتي المقص بحيث يمكن للهواء الدخول إلى البيضة فوق الجنين. استخدم المقص لتوسيع الثقب في القشرة ليصبح دائرة بقطر 1 cm تقريباً. قم بإزالة هذه القطعة من قشرة البيضة.

قم بتغطية الفتحة الموجودة في البيضة بقطعة من الشريط اللاصق الشفاف بمساحة 5 cm مربع تقريباً. اضغط على الشريط ليلتصق فقط عند حافة الفتحة مع ترك الجزء المتبقي من الشريط حراً، حيث يمكن حينها الإمساك بالجزء الحر لفتح إغلاق البيضة بسهولة.

خذ جنيناً في المرحلة 15 من الحاضنة وضع البيضة على مسند للبيض تحت مجهر ثنائي العينية مضبوط على تكبير 3.2x أو أعلى. بعد ذلك، قم بإزالة الطبقة العليا من الشريط اللاصق الشفاف. وباستخدام سكين دقيق من الفولاذ، قم بإجراء شق عبر الغشاء المحي والطبقة المتوسطة الجانبية الملاصقة للجسيدات 26-32 على الجانب الأيمن من الجنين.

ارفع الحاجز باستخدام ملقط دقيق مقاس 5 من أحد طرفيه، ثم قم بتدوير الحاجز لإدخال الطرف الحر في الشق. أغلق البيضة فوراً باستخدام شريط لاصق شفاف وأعدها إلى الحاضنة. في حال الرغبة في إدخال خرزة بالتزامن مع الحاجز، قم أولاً بتحضير خرزات منقوعة في حمض الريتينويك كما هو موضح في البروتوكول النصي المرفق.

بعد ذلك، خذ الخرزة وزوجًا من الملاقط الدقيقة رقم 5 وأدخلهما في الوجه المقطوع من أديم المتوسط الموضعي الجانبي على الجانب القاصي من الشق. ثم، أدخل الحاجز في الشق في موقع دانٍ بالنسبة للخرزة. أغلق البيضة وأعدها على الفور إلى الحاضنة.

إذا كان سيتم إدخال خرزة أو خرزات بدون حاجز، فلا تقم بإجراء الشق الطولي. بدلاً من ذلك، قم بعمل شق صغير عبر الغشاء المحي (vitelline membrane) وصولاً إلى أديم المتوسط للصفيحة الجانبية (lateral plate mesoderm) في الموضع المراد وضع الخرزة فيه. بعد ذلك، خذ الخرزة واستخدم ملقطاً دقيقاً (micro forceps) مقاس 5 وأدخلها في الثقب الموجود في أديم المتوسط للصفيحة الجانبية.

ادفعه للداخل قليلاً باستخدام الأطراف المغلقة للملقط. خذ جنيناً في المرحلة العاشرة بفتحة نافذة من الحاضنة وضع البيضة على مسند للبيض تحت مجهر ثنائي العينية مضبوط على تكبير 3.2x أو أعلى إذا كنت تفضل ذلك. ثم، باستخدام سكين دقيق من الفولاذ، قم بإجراء شق عبر الغشاء المحي والطبقة الجانبية من الميزوديرم، جانبياً بالنسبة للخط البدائي عند الطرف الذيلي للجنين وبمحاذاة الجسيدات، بطول يعادل تقريباً طول ست جسيدات.

بعد ذلك، ارفع الحاجز باستخدام ملقط دقيق مقاس 5 من الطرف البارز من طبق بتري، وقم بتدوير اليد لإدخال الطرف الحر من الحاجز في الشق. قم بسد البيضة فوراً باستخدام شريط لاصق شفاف وأعدها إلى الحاضنة. وفي حال الرغبة في إدخال خرزة بدون حاجز، قم بعمل شق صغير عبر الغشاء المحيّ وتوغل في أديم المتوسط للصفيحة الجانبية عند الموضع المراد وضع الخرزة فيه.

بعد ذلك، خذ الخرزة وزوجاً من الملاقط الدقيقة رقم 5 وأدخلهما في الفتحة الموجودة في أديم المتوسط للصفيحة الجانبية. وأخيراً، ادفعهما إلى الداخل قليلاً باستخدام الطرفين المغلقين للملاقط. يظهر هنا موضع الحاجز عند مستوى الساق المفترضة للجسيدات 26-32 في جنين في المرحلة 15.

يؤدي هذا الحاجز إلى غياب تعبير كل من Fhf10 وFhf8 في منطقة برعم الساق في الجانب الذي خضع للعملية، بينما يظل التعبير موجوداً في الجانب الأيسر غير الخاضع للعملية. ومع ذلك، لوحظ تعبير Tbx4 في كل من المرحلة 19 والمرحلة 23 في الجانب الذي خضع للعملية. وهذا يشير إلى أن تعبير Tbx4 وحده ليس كافياً لبدء نمو الطرف الخلفي من lpm.

عند وضع خرزات منقوعة في حمض الريتينويك بعيداً عن الحاجز في المرحلة 15، يتم التعبير عن Tbx4 و Fgf10 و Fgf8 جميعاً في الجانب الذي أجريت عليه العملية كما هو الحال في جانب التحكم الأيسر. وبالتالي، في التطور الطبيعي، يكون حمض الريتينويك القادم من الجسيدات ضرورياً قبل أن يبدأ نمو برعم الطرف. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام الحواجز غير النفاذة والخرزات المنقوعة في عوامل مرشحة لدراسة كيفية تنظيم الإشارات التحريضية لبدء تكوين برعم الطرف في جنين الدجاج.