تطبيق الحواجز غير نفاذ جنبا إلى جنب مع المرشح عامل الخرز غارقة لدراسة إشارات الاستقرائي في الفرخ

الهدف من هذا التدخل الجراحي هو توضيح آليات تحريض الأطراف في جنين الكتكوت عن طريق منع جزيئات الإشارات من الانتشار من الأنسجة الإنسية إلى الخلايا في الأديم المتوسط الجانبي ودراسة تأثيره على التعبير الجيني. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الأحياء التنموي مثل ، ما هي الإشارات الاستقرائية للتحكم في بدء برعم الأطراف. تتمثل ميزة هذه التقنية في أن جنين الفرخ يمكن الوصول إليه للتلاعب الجراحي وقوي للغاية ، بالإضافة إلى ذلك ، فإن برعم الأطراف للتحكم المقابل غير الخاضع للتشغيل يعمل كعنصر تحكم داخلي مفيد للغاية.

ستعرض سوزان وايلد الإجراء. للبدء ، قم بقص قطعة مربعة بحجم 1 سم من رقائق الألومنيوم بسمك 0.013 مم وتعقيمها عن طريق مسحها بنسبة 70٪ من الإيثانول. ثم ضع المربع على طبق بتري بلاستيكي معقم مقاس 6 سم.

لمنع التشبث الساكن ، تخلص من الغطاء واصنع غطاء جديدا للطبق من نفس الرقاقة. بعد ذلك ، ضع طبق بتري فوق مسرح مسرحي تحت مجهر مجهر تم ضبطه على تكبير 1.6x. استخدم مشرطا صغيرا بالشفرة رقم 15 لقطع شرائط بعرض 1.3 مم من الرقاقة بطول 2 مم.

افصل شرائط القصدير باستخدام زوجين من ملقط صانعي الساعات رقم أربعة. بعد ذلك ، قم بعمل انحناء بزاوية قائمة في وسط حاجز الرقائق بحيث يشبه المفصلة. قم بمحاذاة الحواجز في وسط طبق بتري بحيث يكون جانب واحد مسطحا مقابل الطبق والآخر يشير إلى خارج الطبق ، وقم بإعداد 20 حاجزا أو أكثر قبل يوم العملية.

ضع غطاء القصدير فوق الطبق وقم بتخزين الحواجز في مكان لا يتم إزعاجها فيه. مع وضع البيضة على جانبها ، أمسك زوجا من الملقط القوي من النوع AA بإحكام واستخدم حركة طعن خاضعة للرقابة لاختراق الطرف الحاد للبيضة التي تحتوي على كيس الهواء أثناء إمساك البيضة باليد الحرة. تأكد من كسر غشاء الغلاف الداخلي.

بعد ذلك ، خذ البيضة بكلتا يديك وقلبها 180 درجة على طول محورها الأفقي. بعد ذلك ، خذ قطعة من الشريط اللاصق الشفاف ، حوالي 5 سم مربع وألصقها عن كثب على السطح العلوي للبويضة لمنع قشر البيض من الانهيار على الجنين عند فتح البويضة. استخدم مقصا منحنيا لاختراق القشرة وأغشية الخلايا الداخلية المرتبطة بها برفق في وسط الجزء العلوي من البويضة.

اصنع ثقبا صغيرا جدا بشفرة واحدة من المقص حتى يتمكن الهواء من دخول البويضة فوق الجنين. استخدم المقص لتكبير الفتحة الموجودة في القشرة إلى دائرة يبلغ قطرها حوالي 1 سم. قم بإزالة هذه القطعة من قشرة بحجم البيضة من البيضة.

غطي الفتحة الموجودة على البيضة بقطعة من الشريط اللاصق الشفاف حوالي 5 سم مربع. اضغط على الشريط للصقه فقط على حافة الفتحة ، مع ترك الشريط المتبقي خاليا. يمكن بعد ذلك الإمساك بالشريط المجاني لفتح البيضة بسهولة.

خذ جنينا من المرحلة 15 من الحاضنة وضع البويضة على مسند بويضة تحت مجهر مجهر مضبوطة على تكبير 3.2x أو أعلى. ثم قم بإزالة الطبقة العليا من الشريط الشفاف. باستخدام سكين فولاذي دقيق ، قم بعمل شق من خلال غشاء الزجاجي ووضع الأديم المتوسط الجانبي بجوار الجسيدات 26-32 على الجانب الأيمن من الجنين.

التقط الحاجز بملقط دقيق رقم 5 في أحد طرفيه وقم بلف الحاجز لإدخال الطرف الحر في الشق. في أسرع وقت ممكن ، أغلق البيضة بشريط شفاف وأعيدها إلى الحاضنة. إذا كان سيتم إدخال حبة مع حاجز ، فقم أولا بإعداد حبات مبللة بحمض الريتينويك كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب.

بعد ذلك ، خذ الخرزة وزوجا من الملقط الصغير رقم 5 وأدخله في الوجه المقطوع للأديم المتوسط الجانبي على الجانب البعيد من الشق. ثم أدخل الحاجز في الشق القريب من الخرزة. أغلق البيضة وأعيدها على الفور إلى الحاضنة.

إذا كان سيتم إدخال حبة أو حبات بدون حاجز ، فلا تقم بعمل شق طويل. بدلا من ذلك ، قم بعمل شق صغير من خلال غشاء vitelline وفي الأديم المتوسط الجانبي في الموضع الذي سيتم وضع الخرزة فيه. ثم خذ الخرزة والملقط الصغير رقم 5 وأدخلها في الفتحة الموجودة في الأديم المتوسط الجانبي.

ادفعها قليلا باستخدام الأطراف المغلقة للملقط. خذ جنينا من المرحلة العاشرة من الحاضنة وضع البويضة على مسند بويضة تحت مجهر مجهر مضبوطا على تكبير 3.2x أو أعلى إذا كنت تفضل ذلك. بعد ذلك ، باستخدام سكين فولاذي دقيق ، قم بعمل شق من خلال غشاء vitelline والأديم المتوسط الجانبي ، الجانبي إلى الخط البدائي في الطرف الذيلي للجنين بما يتماشى مع الجسيدات ، بطول ستة أطوال تقريبا.

بعد ذلك ، التقط الحاجز بزوج من الملقط الصغير رقم 5 ، في النهاية بارز من طبق بتري وقم بلف اليد لإدخال الطرف الحر للحاجز في الشق. في أسرع وقت ممكن ، أغلق البيضة بشريط شفاف وأعيدها إلى الحاضنة. إذا كان سيتم إدخال حبة بدون حاجز ، فقم بعمل شق صغير من خلال غشاء الزجاجي وفي الأديم المتوسط الجانبي في الموضع الذي سيتم وضع الخرزة فيه.

بعد ذلك ، خذ الخرزة وزوجا من الملقط الصغير رقم 5 وأدخله في الفتحة الموجودة في الأديم المتوسط الجانبي. أخيرا ، ادفعه إلى الأمام قليلا باستخدام الأطراف المغلقة للملقط. يظهر هنا موضع الحاجز عند مستوى الساق المفترض للجسيدات 26-32 في جنين المرحلة 15.

يؤدي هذا الحاجز إلى غياب تعبير كل من Fhf10 و Fhf8 في منطقة برعم الساق في الجانب الذي تم تشغيله ووجوده في الجانب الأيسر غير الجراح. ومع ذلك ، لوحظ تعبير Tbx4 في كل من المرحلة 19 والمرحلة 23 على الجانب الذي تم تشغيله. هذا يعني أن تعبير Tbx4 وحده لا يكفي لبدء نمو الطرف الخلفي من lpm.

عندما يتم وضع الخرزات المنقوعة بحمض الريتينويك بعيدا عن الحاجز في المرحلة 15 ، يتم التعبير عن كل من Tbx4 و Fgf10 و Fgf8 على الجانب الذي يتم تشغيله لأنهم على جانب التحكم الأيسر. وبالتالي ، في التطور الطبيعي ، يعد حمض الريتينويك من الجسيدات ضروريا قبل بدء نمو برعم الأطراف. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام الحواجز غير المنفذة والخرز المبلوع المرشح لدراسة كيفية تنظيم الإشارات الاستقرائية لبدء برعم الأطراف في جنين الكتكوت.