نموذج الحاد الشبكية لتقييم الدم الشبكية الحاجز خرق والمحتملة أدوية لعلاج

منخفضة التكلفة، يتم تأسيس نظام سهل الاستخدام وقوي لتقييم العلاجات المحتملة التي يمكن أن تحسن خرق الدم حاجز الشبكية الناجم عن الهستامين. وتستخدم تسرب الأوعية الدموية، تنشيط الخلايا مولر واستمرارية العمليات العصبية لتقييم استجابة الضرر وانعكاس مع دواء المحتملة، lipoxin A4.

الهدف العام من هذا النظام النموذجي الشبكية خارج الجسم الحي هو فحص الأدوية, التي تخفف من خرق الحاجز العصبي الدموي. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على العديد من الأسئلة الرئيسية في مجال الأمراض التنكسية العصبية ، مثل ما هي الأحداث المبكرة ، وكيف يمكننا فحص الأدوية التي يمكن أن تساعد في علاج هؤلاء المرضى. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها منخفضة التكلفة وسهلة الاستخدام وسريعة وقابلة للتكيف.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن الحصول على بيانات موثوقة وقابلة للتكرار يعتمد على المهارات التقنية لتوليد عينات جيدة. يتم استخدام شبكية الخنازير الأولى ، التي تم الحصول عليها من مصدر تجاري ، هنا. بعد الشراء من المصدر ، يجب حفظ مقل العيون عند أربع درجات ، أو على الجليد ، ومعالجتها في أسرع وقت ممكن.

ابدأ التشريح في غطاء مزرعة الأنسجة عن طريق القطع حول العدسة لفتح غطاء العين. ثم باستخدام فرشاة ، قم بإزالة الخلط الزجاجي برفق ، دون شد شبكية العين. استخدم فرشاة لفصل الشبكية برفق عن الحافة المقطوعة ، لكشف القرص البصري.

قطع العصب البصري بشفرة حلاقة وتحرير شبكية العين. انقل شبكية العين إلى طبق بتري واشطف شبكية العين بعناية مرة واحدة باستخدام HBSS البارد. ضع العينة في HBSS على الجليد.

بعد ذلك ، استخدم ماكينة حلاقة لقطع شبكية العين إلى نصفين بشكل متماثل. عندما تكون العلاجات مطلوبة ، يتم علاج نصف شبكية العين ، بينما يجب معالجة النصف الآخر من نفس شبكية العين لتعيين خط الأساس وتصحيح الاختلافات الحيوانية. انقل العينات برفق إلى صفيحة من ستة آبار تحتوي على ثلاثة ملليلتر من وسط التثبيت لكل بئر.

قم بموازنة شبكية العين لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة مع احتواء الغلاف الجوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد الحضانة ، قم بشفط وسط التثبيت بعناية ، وأضف ثلاثة ملليلتر من الوسط الذي يحتوي على الهيستامين و LXA4 إلى كل بئر. احتضان العينات لمدة ساعة أخرى.

بعد الشطف باستخدام PBS المعقم الدافئ ، أضف ثلاثة ملليلتر من 4٪ PFA إلى كل بئر واحتضنه لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بمجرد انقضاء وقت الحضانة ، قم بشفط PFA بسرعة واشطف العينات مرة واحدة باستخدام PBS. أضف 10٪ سكروز إلى الآبار واحتضن لمدة ساعتين إلى أربع ساعات عند أربع درجات مئوية.

بعد ذلك ، استبدل السكروز بنسبة 10٪ ب 30٪ من السكروز واحتضنه طوال الليل عند أربع درجات مئوية. ثم امزج جزءا واحدا من وسط التجميد التجاري مع جزأين 20٪ سكروز ، لجعل وسط التجميد العملي. اتركيه عند أربع درجات مئوية طوال الليل أو أكثر حتى تختفي فقاعات الهواء.

في اليوم التالي ، استبدل السكروز بنسبة 30٪ بوسط تجميد يعمل ، واتركه يتوازن لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد التوازن ، قم بقص كل شبكية العين إلى مستطيلات بمقدار ثلاثة ملليمترات في خمسة ملليمترات ، ثم قم بتجميد شرائح شبكية العين عن طريق وضعها في وسط تجميد ، موجود في أسطوانة من رقائق الألومنيوم. تأكد من أن شرائح الشبكية عمودية لتوفير مقطع عرضي لشبكية العين عند التقطيع ، وقم بتجميدها في النيتروجين السائل.

قسم كل كتلة على ناظم البرد إلى شرائح 14 ميكرون ، وقم بتركيب الأقسام على شرائح زجاجية. قم بتخزين الشرائح على حرارة سالب 80 درجة مئوية حتى الاستخدام. ابدأ في التلوين المناعي عن طريق غسل الأقسام باستخدام 5٪ من فوسفات السكروز ، أو SPB.

ثم قم بحظر مواقع الربط غير المحددة ، عن طريق احتضان الأقسام ومنع المخزن المؤقت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، احتضان الأقسام بالجسم المضاد الأولي المناسب لمدة ساعة واحدة. بمجرد انقضاء الساعة ، قم بشفط المحلول وغسل الأقسام ثلاث مرات بنسبة 5٪ SPB.

ثم احتضان الأقسام بالأجسام المضادة الثانوية المقابلة لمدة ساعة واحدة ، بينما تكون محمية من الضوء. بعد غسل الأقسام ثلاث مرات باستخدام 5٪ SPB ، قم بإعداد العينات للفحص المجهري عن طريق تركيبها في وسط يحتوي على DAPI ، وتغطيتها بزلات غطاء. أخيرا ، التقط الصور باستخدام مجهر متحد البؤر.

لقياس عرض العملية ، استخدم أداة العدسة المكبرة لاختيار منطقة من القسم حيث يتم إجراء العمليات ، مثل الطبقة النووية الخارجية. ثم اختر مجالا بصريا حيث تكون هذه العمليات مرئية ومستمرة. انقر فوق أداة التحليل في القائمة الرئيسية ثم انقر فوق تعيين المقياس في القائمة الفرعية ، لتعيين شريط المقياس وفقا للإعداد المجهري.

حدد وظيفة الخط في القائمة الرئيسية وارسم خطا عبر العملية. انقر فوق تحليل في القائمة الرئيسية ، ثم انقر فوق القياس في القائمة الفرعية ، لإجراء القياس. لتحليل استمرارية العملية ، ارجع إلى القائمة الرئيسية واستخدم وظيفة المضلع لتحديد طبقة شبكي الداخلية كمنطقة اهتمام.

قم بقياس المنطقة بالنقر فوق تحليل ثم قياس. انقر فوق العملية والتصفية ثم المتغيرات لتحسين الحواف في الصورة عن طريق استبدال كل بكسل بمتغير الجوار الخاص به. ثم اضبط التباين والسطوع تلقائيا بالنقر فوق الصورة ، والضبط ، والسطوع والتباين ، ثم تلقائي في القائمة الفرعية.

ثم عد الخطوط. في هذه الصور ، يظهر التفاعل المناعي IGG باللون الأحمر. في مجموعات التحكم ، يتم تقييد IGG داخل الأوعية الدموية.

في مجموعة الهيستامين ، يتم الكشف عن IGG من الأوعية الدموية ، حيث يشكل سحب تسرب يشار إليها بدوائر منقطة. في المجموعات المعالجة ب LXA4 ، يتم تقييد IGG مرة أخرى داخل الأوعية الدموية. إضافة أخرى ل LXA4 تنقذ وظيفة الأوعية الناجمة عن الهيستامين.

يوضح هذا الرسم البياني النسبة المئوية للأوعية الدموية المتسربة عبر المجموعات التي تم اختبارها. في هذه الصور يتم تقديم تلوين مناعي ل GFAP, أي يلطخ خلايا مولر. يتم الحصول على تلطيخ إيجابي في عمليات خلايا مولر ، عبر شبكية العين ، وحول الأوعية الدموية.

يتم تقديم عرض عمليات خلية مولر ، من جميع المجموعات. العلاج بالهيستامين ، أو LXA4 وحده ، يقلل من عرض العملية. ولكن عندما تم تطبيق كلا الكواشف معا ، تم إنقاذ عرض العملية.

في هذه الصور ، يتم تقديم التلوين المناعي ل MAP2. لوحظ تلطيخ إيجابي من العمليات والأجسام الخلوية للخلايا العقدية. يتم تقديم كثافة عمليات الخلايا العقدية الموجبة المستمرة MAP2 من جميع المجموعات.

يقلل العلاج بالهيستامين من استمرارية العمليات المتغصنة ، بينما لا يوجد تأثيرات كبيرة ل LXA4. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التجربة في غضون ثلاثة إلى خمسة أيام ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح ، مع خمس دقائق لكل شبكية للتشريح ، وست دقائق للعلاج ، تليها التقسيم ، والتلوين المناعي ، والتحليل. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم استخدام الأنسجة الطازجة والضوابط المناسبة.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إضافة طرق أخرى مثل التصوير المباشر ، لتتبع التغيرات في الوقت الفعلي في مستويات الكالسيوم وخصائص الميتوكوندريا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام نموذج ثقافة الشبكية الحادة خارج الجسم الحي ، لإنشاء خلل وظيفي في BRB ، وتقييم الضرر ، وفحص الأدوية المحتملة. شكرا جزيلا لك على المشاهدة وكل التوفيق مع تجاربك.