مقايسة على أساس CFSE لدراسة الهجرة من الجلد الفئران الخلايا الجذعية في تصريف الغدد الليمفاوية خلال العدوى مع

الهدف العام من هذا المقايسة المعتمدة على تتبع الخلايا الفلوري هو مراقبة وتوصيف مجموعات خلوية محددة ذات أهمية أثناء هجرتها من الجلد إلى العقدة اللمفاوية المصرّفة بعد إصابة وسادة القدم بعصية كالميت-جيرين، أو BCG. لقد استخدمنا هذه التقنية لتحديد مجموعة الخلايا التغصنية التي تستقر في العقدة اللمفاوية المصرّفة بعد إصابة الجلد بـ BCG. وقد أتاحت هذه التقنية دراسة هجرة الخلايا عن طريق حقن الأورام خلال نافذة زمنية محددة مدتها 24 ساعة.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، حيث يصعب تعلم خطوات حقن وسادة القدم وعزل العقدة الليمفاوية من خلال النصوص. بالنسبة لحقن *Mycobacterium bovis* BCG، وبعد التأكد من الوصول إلى المستوى المناسب من التخدير عن طريق قرص إصبع القدم، استخدم سرنجة مزودة بإبرة قياس 29 وقطر 1/2 بوصة لتلقيح وسادة القدم الخلفية لفأر يتراوح عمره بين 8 إلى 12 أسبوعاً بـ 1×10⁶ وحدة تشكيل مستعمرة من البكتيريا في 30 µL من PBS. يتم حقن وسادات القدم الضابطة بـ PBS فقط.

بعد ذلك، راقب الحيوانات حتى تصبح مستلقية تماماً وغير قادرة على تحميل الوزن على وسادة القدم المحقونة. وبالنسبة لحقن CFSE، وفي النقطة الزمنية المناسبة بعد حقن BCG، قم بتخفيف عبوة من CFSE بتركيز five millimolar في درجة حرارة الغرفة بمقدار عشرة أضعاف في PBS، مع الحرص على إعادة تعليق المحلول جيداً. ثم املأ المحقنة بـ CFSE المخفف واحقن 20 microliters في نفس وسادة القدم الخلفية التي تلقت الحقنة الأولى.

بعد مرور 24 ساعة من حقن CFSE، قم بإجراء شق عمودي بعناية في الفخذ الخلفي، وأزل الدهون العضلية. بعد ذلك، استخدم المقص والملاقط للكشف عن العقدة اللمفاوية المأبضية (Popliteal Lymph Node) واستئصالها، والتي تقع في عمق الكيس الدهني في تجويف الركبة. انقل العقدة اللمفاوية إلى 0.5 milliliters من PBS المعقم على الثلج، وقم بتجانس العقدة اللمفاوية عبر مصفاة خلايا بقطر 70 micron داخل إحدىة آبار لوحة ذات ستة آبار تحتوي على خمسة milliliters من PBS باستخدام الطرف الخلفي لمحقانة سعة ثلاثة milliliters.

اغسل المصفاة بـ 5 ميليلتر أخرى من المنظم، وانقل محلول الخلايا إلى أنبوب سعة 15 ميليلتر. بعد ذلك، قم بطرد الخلايا مركزياً وأعد تعليق الراسب في حجم كافٍ من المنظم. لوسم الخلايا من أجل قياس التدفق الخلوي، سأضع من 1 إلى 10 × 10⁶ خلية في أنابيب بوليسترين ذات قاع مستدير سعة 5 ميليلتر وأغسل الخلايا باستخدام منظم FACS جديد.

أعد تعليق الراسبات في 50 إلى 100 µL من مزيج الأجسام المضادة المناسب الذي يحتوي على anti-mouse CD16 CD32 لمنع التفاعلات غير النوعية التي تتوسطها مستقبِلات FC في منظم FACS، على الثلج، مع الحماية من الضوء. بعد 30 إلى 45 دقيقة، اغسل الخلايا في منظم FACS وأعد تعليق الراسبات في 50 إلى 100 µL من منظم FACS جديد. لوحظ أن غالبية وسم CFSE في العقدة اللمفاوية المأبضية تكون في الخلايا ذات التعبير العالي عن MHC-II والتعبير المنخفض الإيجابي عن CD11c، وهو ما يتفق مع الخلايا التغصنية الجلدية التي تهاجر إلى العقد اللمفاوية التي تصرف الجلد.

يظهر كل من تكرار والعدد الإجمالي لهذه الخلايا الموصومة بأعداد متزايدة في العقد اللمفاوية المأبضية لدى الفئران المصابة بـ BCG، مقارنة بمجموعات التحكم التي حُقنت بـ PBS، مما يشير إلى أن BCG يعزز إعادة توطين هذه الخلايا إلى العقدة اللمفاوية النازحة. وتستمر الخلايا التغصنية الجلدية في الدخول إلى اللمف النازح لمدة تصل إلى خمسة أيام بعد العدوى، مما يمدد هجرة الخلايا التغصنية في النموذج الحالي إلى ما بعد الجدول الزمني للتنشيط الأولي لخلايا T الموجبة لـ CD4 النوعية للمستضد في العقدة اللمفاوية المأبضية. علاوة على ذلك، تعبر الخلايا التغصنية الجلدية المهاجرة عن مستويات مرتفعة من الجزيئات المحفزةร่วม، مما يدعم مفهوم أن هذه الخلايا التغصنية المهاجرة تكون منشطة.

ومن المهم ملاحظة أن كلاً من الخلايا الغصنية أحادية الشكل (mono-cytoid) والبلازمية الشكل (plasma-cytoid) المقاومة في العقد اللمفاوية، والتي تدخل العقد اللمفاوية الملتهبة عبر الوريدات عالية البطانة وليس عبر الأوعية اللمفاوية الواردة، كانت سلبية لـ CFSE، مما يؤكد مجدداً أن وسم CFSE يحدث بشكل أساسي في وسادة القدم. علاوة على ذلك، يكشف تحليل إضافي باستخدام قياس التدفق الخلوي أن مجموعة فرعية من الخلايا ذات التعبير المنخفض عن EpCAM والتعبير المرتفع عن CD11b هي المجموعة الرئيسية من الخلايا الغصنية الجلدية المهاجرة التي تنتقل إلى العقدة اللمفاوية المأبضية استجابةً للعدوى بـ BCG. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون خمس دقائق إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة تنفيذ هذه العملية، من المهم توخي الحذر فيما يتعلق بموقع الحقن وحجم الحقنة؛ ويجب بذل عناية كبيرة لتجنب إتلاف العقدة اللمفاوية المصرّفة أثناء عملية التشريح. وفي أعقاب هذا الإجراء، يمكن إجراء طرق أخرى مثل قياس التدفق الخلوي أو المجهر البؤري للتحليل الإضافي للتعبير الدقيق للخلايا الخاصة بمجموعات فرعية معينة. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين لتتبع الخلايا من الجلد إلى العقدة اللمفاوية المصرّفة، خلال فترة 24 ساعة استجابةً للعدوى أو التطعيم.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء حقن وسادة القدم، وكيفية تحديد وعزل العقد الليمفاوية المصرّفة لتتبع وتوصيف مجموعات الخلايا الشجرية المهاجرة ذات الأهمية.