Name: تنبيغ-زرع نموذج الفأر من مرض تكاثر نقوي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: تعلم طريقة التنبيغ-الزرع لإنشاء نماذج فئران تعبّر عن جينات محددة في الخلايا الدموية. تُستخدم هذه التقنية لدراسة الأورام الدموية وفحص دور الجينات في تكوّن الدم الطبيعي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

هذا العمل مدعوم من قبل V Foundation Scholar (AGF) ومؤسسة أبحاث MPN (AGF).

<ol><li>Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDaley%2C+GQ+%22Science%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science(New York, N.Y.)</a>. 247 (4944), 824-830 (1990).</li>
<li>Wernig, G., Mercher, T., Okabe, R., Levine, R. L., Lee, B. H., Gilliland, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Jak2V617F+causes+a+polycythemia+vera-like+disease+with+associated+myelofibrosis+in+a+murine+bone+marrow+transplant+model%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Expression of Jak2V617F causes a polycythemia vera-like disease with associated myelofibrosis in a murine bone marrow transplant model.</a> Blood. 107 (11), 4274-4281 (2006).</li>
<li>Lacout, C., Pisani, D. F., Tulliez, M., Gachelin, F. M., Vainchenker, W., Villeval, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAK2V617F+expression+in+murine+hematopoietic+cells+leads+to+MPD+mimicking+human+PV+with+secondary+myelofibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">JAK2V617F expression in murine hematopoietic cells leads to MPD mimicking human PV with secondary myelofibrosis.</a> Blood. 108 (5), 1652-1660 (2006).</li>
<li>Zaleskas, V. M., Krause, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathogenesis+and+therapy+of+polycythemia+induced+in+mice+by+JAK2+V617F%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Molecular pathogenesis and therapy of polycythemia induced in mice by JAK2 V617F.</a> PloS One. 1, e18(2006).</li>
<li>Bumm, T. G. P., Elsea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+murine+JAK2V617F-positive+myeloproliferative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of murine JAK2V617F-positive myeloproliferative disease.</a> Cancer Res. 66 (23), 11156-11165 (2006).</li>
<li>Marty, C., Pecquet, C., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarty%2C+C+%22Calreticulin+mutants+in+mice+induce+an+MPL-dependent+thrombocytosis+with+frequent+progression+to+myelofibrosis%22">Calreticulin mutants in mice induce an MPL-dependent thrombocytosis with frequent progression to myelofibrosis</a>. , Blood. (2015).</li>
<li>Klampfl, T., Gisslinger, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mutations+of+calreticulin+in+myeloproliferative+neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms.</a> N. Engl. J. Med. 369 (25), 2379-2390 (2013).</li>
<li>Araki, M., Yang, Y., et al. Activation of the thrombopoietin receptor by mutant calreticulin in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAraki%2C+M+%22Blood%22">Blood</a>. , (2016).</li>
<li>Limón, A., Briones, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Titer+Retroviral+Vectors+Containing+the+Enhanced+Green+Fluorescent+Protein+Gene+for+Efficient+Expression+in+Hematopoietic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-Titer Retroviral Vectors Containing the Enhanced Green Fluorescent Protein Gene for Efficient Expression in Hematopoietic Cells.</a> Blood. 90 (9), 3316-3321 (1997).</li>
<li>Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+bone+marrow+transplantation+%28BMT%29%3A+providing+optimal+veterinary+and+husbandry+care+to+irradiated+mice+in+BMT+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Assoc.+Lab.+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies.</a> J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48 (1), 11-22 (2009).</li>
<li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Replication-Defective+Retrovirus+by+Transient+Transfection+of+293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells.</a> J. Vis. Exp. (10), (2007).</li>
<li>Challen, G. A., Boles, N., Lin, K. K., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Hematopoietic+Stem+Cell+Identification+And+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Mouse Hematopoietic Stem Cell Identification And Analysis.</a> Cytometry A. 75 (1), 14-24 (2009).</li>
<li>Ergen, A. V., Jeong, M., Lin, K. K., Challen, G. A., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+mouse+side+population+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Bio.+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of mouse side population cells.</a> Methods Mol. Bio. (Clifton, N.J.). 946, 151-162 (2013).</li>
<li>Weksberg, D. C., Chambers, S. M., Boles, N. C., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD150-+side+population+cells+represent+a+functionally+distinct+population+of+long-term+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD150- side population cells represent a functionally distinct population of long-term hematopoietic stem cells.</a> Blood. 111 (4), 2444-2451 (2008).</li>
<li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+markers+resolve+functionally+distinct+subpopulations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li>
<li>Li, J., Kent, D. G., Chen, E., Green, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+myeloproliferative+neoplasms%3A+JAK+of+all+grades%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model.+Mech%22%5BJournal%5D)">Mouse models of myeloproliferative neoplasms: JAK of all grades.</a> Dis. Model. Mech. 4 (3), 311-317 (2011).</li>
<li>Mullally, A., Lane, S. W., Brumme, K., Ebert, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloproliferative+neoplasm+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Hematol.+Oncol.+Clin.+North+Am%22%5BJournal%5D)">Myeloproliferative neoplasm animal models.</a> Hematol. Oncol. Clin. North Am. 26 (5), 1065-1081 (2012).</li>
<li>Scil animal care company GmbH. , Source: 
 <a target="_blank" href="http://www.scilvet.us/company-downloads">http://www.scilvet.us/company-downloads</a> (2005).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

يوفر هذا البروتوكول وصفا مفصلا لكيفية إجراء عمليات زرع نخاع العظام في الفئران أن ألخص مرض الضرورية مثل كثرة الصفيحات مع التقدم إلى تليف النقي مع CALRdel52 طفرة باعتباره المحرك من المرض. زراعة ناجحة من الخلايا معربا عن النتائج CALRdel52 في زيادة الصفائح الدموية، وتوسيع الخلايا السوية العرطلة، وتليف نخاع العظام. كما زرع نخاع العظام هي عملية متعددة الخطوات، من المهم أن نعترف الخطوات التي يمكن تجنبها خطأ فني لمنع engraftment الفقراء من الخلايا معربا عن الجينات في المصالح أو حتى الموت ...

تنبيغ الزرع هو طريقة مفيدة لنموذج الأورام الخبيثة الدموية في الفئران. وكانت هذه التقنية قيمة خاصة لدراسة الأورام الخبيثة النخاعي التي يعود تاريخها إلى اول دليل على ان التعبير خارج الرحم من BCR-ABL1 يمكن أن ألخص بأمانة ابيضاض الدم النقوي المزمن في الفئران 1. وقد سهلت هذه التقنية فيما بعد دراسة مستفيضة من JAK2 V617F وMPL W515K / L تحور مرض تكاثر نقوي (MPN). مبن مجموعة من الأورام الخبيثة الدموية التي تتميز الافراط في خلايا الدم النخاعي ناضجة وتليف نخاع العظام. تنشأ هذه الأمراض عموما من توسع نسيلي من الخلايا الجذعية المكونة للدم الذي حصل طفرة جسدية في أي JAK2، MPL، أو CALR. تنبيغ-زرع JAK2 V617F وMPL W515K / نماذج L معرض المظاهر السريرية فيرا كثرة الحمر وتليف النقي 2-5 &lt;/ سوب&gt;. في الآونة الأخيرة، كما تم إنشاء نموذج الفأر من-تحور calreticulin مبن مع أسلوب التنبيغ الزرع 6. هذه الفئران تطوير مرض الضرورية مثل كثرة الصفيحات مع زيادة الصفائح الدموية، وزيادة عدد الخلايا السوية العرطلة، وتليف نخاع العظام. معا، وقد وفرت هذه النماذج ليس فقط الفرصة لاكتساب نظرة ثاقبة على المرضية الجزيئية من مبن، ولكن أيضا القدرة على تطوير ودراسة العلاجات في أجواء ما قبل السريرية. توفر هذه المخطوطة وصفا مفصلا لمنهجية التنبيغ الزرع مع التركيز على طفرة CALRdel52. تتضمن هذه التقنية زرع خلايا نخاع العظام transduced retrovirally معربا عن متحولة بناء في الفئران المتلقي مسانج المشع.

<table><tbody><tr><td><خطوط خلايا > قوية < / قوية ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>DMEM</td><td>كورنينج</td><td>MT-10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>293T خلايا</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>خلايا 3T3</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr> <tr><td>< قوية > البلازميدات < / قوية ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EcoPak ، والمعروفة أيضا باسم pCL-Eco</td><td>Addgene</td><td>12371</td><td>يمكن استخدام خطوط خلايا التعبئة والتغليف الفيروسية القهقرية ، مثل EcoPack 2-293 ، بدلا من بلازميد EcoPak وخلايا 293T القياسية. تتوفر بلازميدات تغليف وتغليف إضافية من "جاما؛-الفيروسات القهقرية من Addgene وغيرها.</td></tr><tr><td>MSCV-IRES-GFP (MIG)</td> <td>Addgene</td><td>20672</td> تتوفر <td>بلازميدات نقل الفيروسات القهقرية الإضافية من Addgene وغيرها.</td></tr><tr><td><مستهلكات قوية> مستهلكات< / قوية></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>27 جم × 1/2 بوصة إبر</td><td>BD</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>مصل الأبقار الجنيني</td><td>Corning</td><td>MT-35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>البنسلين / الستربتومايسين / L-الجلوتامين</td><td>Corning</td><td>MT-30-009-CI</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05٪)</td> <td>Corning</td><td>MT-25-052-CI</td><td>يمكن أن يكون PBS محلي الصنع</td></tr><tr><td></td><td>أطباق Corning</td><td>MT-21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>10 سم</td><td>فيشر</td><td>172931</td><td></td></tr><tr><td>15 مل أنابيب مخروطية</td><td>فيشر</td><td>12565268</td><td></td></tr><tr><td>أطباق 60 مم</td><td>فيشر</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>بوليبرين</td><td></td><td>فيشر NC9840454</td><td></td></tr><tr><td>5-FU</td><td>فيشر</td><td>A13456-06</td><td></td></tr><tr><td>100 & # 181; مصافي الخلية m</td><td>فيشر</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>50 مل أنابيب مخروطية</td><td>فيشر</td><td>12565270</td><td></td></tr><tr><td>6 آبار</td><td>فيشر</td><td>130184</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب FACS</td><td>فيشر</td><td>14-959-5</td><td></td></tr><tr><td>0.45 & مرشحات المحقنة m</td><td>فيشر</td><td>0974061B</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>ACK buffer</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>يمكن أن يكون الفأر المؤتلف محلي الصنع</td></tr><tr><td>IL-3</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>الفأر المؤتلف IL-6</td><td>Peprotech</td><td>216-16</td><td></td></tr><tr><td>الفأر المؤتلف SCF</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365809001</td><td>كاشف النعداء</td></tr><tr><td>1.5 مل أنابيب الطرد المركزي</td><td>الولايات المتحدة الأمريكية العلمية</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td><قوي>المعدات< / قوي></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD أككوري C6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>الأشعة</td><td></td><td></td><td></td> السينية</tr></tbody></table>

تنبيغ-زرع نموذج الفأر من مرض تكاثر نقوي

Transduction-Transplantation Mouse Model of Myeloproliferative Neoplasm

زرع التنبيغ هو طريقة سريعة وفعالة لنمذجة الأورام الخبيثة الدموية البشرية في الفئران. ينتج عن هذه التقنية التعبير عن الجين المهم في الخلايا المكونة للدم ويمكن استخدامها لدراسة دور الجين في تكون الدم الطبيعي و / أو الخبيث. يوفر هذا البروتوكول وصفا مفصلا حول كيفية إجراء عملية نقل التنبيغ باستخدام طفرات الكالريتيكولين (CALR) التي تم تحديدها مؤخرا في الورم التكاثري النقوي (MPN) كمثال. في هذا البروتوكول ، يتم نقل خلايا نخاع العظم الكامل من الفئران المانحة المعالجة 5-flurouracil (5-FU) بفيروس قهقري يشفر CALR الطافرة وزرعها في مضيفين متجانسين معرضين للإشعاع المميت. يتم تمييز الخلايا المانحة التي تعبر عن CALR المتحور ببروتين الفلورسنت الأخضر (GFP). تطور الفئران المزروعة نمطا ظاهريا ل MPN بما في ذلك الصفائح الدموية المرتفعة في الدم المحيطي ، وتوسع الخلايا الضخمة في نخاع العظام ، وتليف نخاع العظم. نحن نقدم وصفا خطوة بخطوة لكيفية توليد الفيروسات القهقرية ، وحساب العيار الفيروسي ، وتحويل خلايا نخاع العظم الكاملة ، وزرعها في الفئران المتلقية المشععة.

نتائج تقنية التنبيغ الزرع في إعادة المكونة للدم من الفئران المتلقي مع الخلايا معربا عن الجينات في المصالح. ويبين الشكل 1 لمحة عامة عن نموذج الفأر التنبيغ-زرع calreticulin تحور MPN. لفترة وجيزة، الارتجاعي معربا عن CALRwt أو CALRdel52 يستخدم لتصيب الخلايا BM من الماوس المانحة C57B / 6. يتم زرع خلايا Transduced في المشع C57B / 6 الماوس المتلقي والخلايا المانحة engraftment يحدث خلال الشهر الأول بعد زرع. أدلة على وجود النمط الظاهري يصبح...

تقدم هذه المخطوطة وصفا للمنهجية المستخدمة لإنشاء نماذج فأر التحويل والزرع. يتم تقديم وصف مفصل للأخطاء الفنية التي يجب تجنبها عند إجراء عمليات زرع نخاع العظم. يجب اكتساب فهم واضح لأهمية ارتفاع عيار الفيروس ، والتعدي / التنبيغ ، والتشعيع.

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج فئران تعبر عن الجين المستهدف في الخلايا المكونة للدم باستخدام طريقة التنقيل والزرع. يمكن لهذه الطريقة، خلال فترة زمنية قصيرة، المساعدة في الإجابة عما إذا كان الجين المستهدف يؤدي إلى حدوث خباثة دموية. وتمتد تطبيقات هذه التقنية إلى علاج أو تشخيص الخباثات الدموية، وذلك بفضل التطوير السريع لنماذج فئران يمكنها اختبار العلاجات المفترضة.على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول الأورام الدموية الخبيثة، إلا أنه يمكن استخدامها أيضاً لدراسة دور جين معين في عملية تكوين الدم الطبيعية. وبوجه عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه التجربة بعض الصعوبات، نظراً لأنها تتطلب خطوات متعددة. كما أن إنتاج فيروسات ذات عيار مرتفع يعد أمراً حاسماً لنجاح هذه التجربة.يُعد العرض المرئي لهذا الإجراء أمراً هاماً، حيث إن العمل مع الفئران قد يكون صعباً ويتطلب التدريب. بعد تخدير الفأر، والتحقق من عمق التخدير وفقاً للبروتوكول المكتوب، ضع الفأر على جانبه، وباستخدام الإبهام والسبابة، قم بتثبيت الحيوان بحيث تبرز العين قليلاً من الرأس. لحقن 150 mg/kg من 5-flurouracil، أو 5-FU، عبر الحقن خلف المدار، أدخل إبرة قياس 27 بنصف بوصة بزاوية 45 درجة مع توجيه الشطب للأعلى في اتجاه إنسي، وتوقف عندما يتم إدخال الإبرة إلى منتصف المسافة.احقن المحلول ببطء، ثم اسحب الإبرة بعناية. افحص الفأر بحثاً عن أي علامات إصابة، مثل التورم أو النزيف، وتأكد من تعافي الفأر وبدئه في المشي. بعد خمسة أيام، وعقب التضحية بالحيوان وفقاً للبروتوكول النصي، استخدم ethanol 70% لتعقيم الفأر عن طريق الرش بوفرة حتى يبتل الفرو.باستخدام مقص التشريح، قم بعمل شق في الجلد، وفصل اللفافة عن عضلات الساق. بعد ذلك، افصل الساق عن الفأر عن طريق قطع عظم الفخذ عند الورك، وعظم الظنبوب عند الكاحل. اثنِ الساق على شكل حرف L واستخدم مقص التشريح لفصل كل عظمة في الساق عن طريق القطع عند مفصل الركبة.بعد ذلك، يتم كشط العضلة برفق باتجاه أحد طرفي عظمة الساق حتى ينفصل الغضروف. تالياً، وباستخدام حقنة ذات إبرة مقاس 27-gauge وطول نصف بوصة، وبمحلول PBS مضاف إليه 2%FBS، يتم غسل كل عظمة ساق فوق غشاء نايلون بمسامية 100 micrometer في أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter، حتى يتحول لون العظمة إلى الأبيض لزيادة عدد الخلايا المستخلصة إلى أقصى حد. وباستخدام مكبس الحقنة، يتم دفع الخلايا عبر غشاء النايلون إلى داخل الأنبوب المخروطي سعة 50 milliliter للحصول على معلق خلوي أحادي.كرر العملية مع ساق الفأر الأخرى. قم بطرد الخلايا التي تم جمعها مركزياً عند 400 ×g في درجة حرارة 4 °C لمدة 10 دقائق، ثم تخلص من السائل الطافي. بعد ذلك، أضف 5 mL من كلوريد الأمونيوم والبوتاسيوم، أو ACK، لإعادة تعليق نخاع العظم.قم بتحضين معلق الخلايا على الثلج لمدة 10 دقائق لتحليل خلايا الدم الحمراء. ولإيقاف عملية التحليل، املأ الأنبوب باستخدام PBS. بعد ذلك، قم بطرد الخلايا مركزياً مرة أخرى، وتخلص من السائل العلوي.أعد تعليق الخلايا باستخدام 5 mL من PBS، وباستخدام طريقة استبعاد صبغة Trypan blue، استخدم مقياس كرات الدم (hemocytometer) لعدّ الخلايا. الآن، أضف 2x pre-stem cocktail لإعادة تعليق الخلايا بتركيز 2 × 10⁶ خلية لكل mL. بعد ذلك، وزع 2 mL في آبار أطباق ذات 6 آبار.قم بحضن الخلايا عند درجة حرارة 37 °C، وبتركيز 5% من ثاني أكسيد الكربون طوال الليل. بعد الحضن، أضف 2 mL من السائل الطافي الفيروسي إلى كل بئر، يليه 8 µg/mL من polybrene. قم بتدوير الأطباق بسرعة 1500 ×g عند درجة حرارة 30 °C لمدة 90 دقيقة.بعد ذلك، أعِد الأطباق إلى الحاضنة طوال الليل. انقُل معلق الخلايا باستخدام الماصة إلى أنابيب مخروطية، ثم قم بالطرد المركزي عند 400 ×g في درجة حرارة 4 °C لمدة 10 دقائق. استخدم 2x pre-stem cocktail لكل بئر لإعادة تعليق الخلايا، ثم أعد زراعتها في الآبار الأصلية.بعد تحضير الفئران المستقبلة للزراعة وفقاً لبروتوكول النص، يتم حصاد الخلايا المانحة المنقولة من أطباق الستة آبار عن طريق سحب السائل الطافي بلطف باستخدام الماصة ونقله إلى أنابيب مخروطية. استخدم 1 mL من PBS لغسل كل بئر، واجمع الخلايا المتبقية في الأنابيب. أضف 0.5 mL من trypsin بتركيز 0.05% إلى الآبار، ثم حضنها عند 37 °C لمدة خمس دقائق.بعد ذلك، أضف 1 mL من D-10 إلى الآبار، وقم بفصل أي خلايا متبقية عن طريق السحب اللطيف باستخدام الماصة. ثم، أضف الخلايا إلى الأنابيب المخصصة لها وقم بترسيبها عند 400 ×g في درجة حرارة 4 °C لمدة 10 دقائق. اغسل الخلايا مرة أخرى باستخدام PBS.بعد ذلك، وبعد عملية الطرد المركزي، استخدم 5 mL من PBS لإعادة تعليق الخلايا، ثم قم بعدها باستخدام طريقة استبعاد صبغة Trypan blue ومقياس كرات الدم (hemocytometer). وللحقن في الفئران، أعد تعليق 5×10⁵ إلى 2×10⁶ خلية في 50 إلى 100 µL من PBS. ضع الفأر على جانبه، وثبته باستخدام الإبهام والسبابة، بحيث تبرز العين قليلاً عن الرأس.أدخل الإبرة بجانب المآق الإنسي بزاوية 45 درجة، بحيث يكون الشطب متجهًا للأعلى، ثم قم بالحقن. بعد الحقن، افحص الفأر بحثًا عن أي علامات إصابة في موقع الحقن، مثل التورم أو النزيف، وارجع إلى البروتوكول المكتوب للحصول على تفاصيل إضافية حول الرعاية ما بعد الحقن. وأخيرًا، قم بتحليل تعبير GFP في الدم، وفقًا للبروتوكول المكتوب.يوضح هذا الشكل كيفية حساب عيار الفيروس النسبي حيث يتم حساب النسبة المئوية لـ GFP من الأحداث التي تم جمعها من بوابة الخلايا الحية. يظهر هنا عيار يحتوي على أكثر من جسيم فيروسي واحد لكل خلية، وتمثل هذه العينات عيارات تحتوي على جسيمات فيروسية مفردة لكل خلية. ومن الناحية المثالية، ينبغي اكتشاف ما لا يقل عن 50% من الخلايا الموجبة لـ GFP مع تخفيف من 1 إلى 30 من السائل الطافي الفيروسي.في هذه التجربة، يتم عرض حالة متلقٍ ناجح لعملية زرع، حيث تظهر الفئران من سلالة CALRdel52 نمطاً ظاهرياً لـ MPN يتميز بزيادة في الصفائح الدموية، وزيادة في الخلايا النواء في نخاع العظم، وتليف في نخاع العظم. بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في ثمانية أيام إذا نُفذت بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم اتباع كل خطوة من خطوات البروتوكول.بعد تطوير هذه التقنية، مهدت الطريق للباحثين لاستكشاف تأثيرات جينات محددة في عملية تكوين الدم. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية إنتاج فئران تعبر عن الجين المستهدف في الخلايا المكونة للدم.

transduction-transplantation-mouse-model-myeloproliferative

Research

JoVE Journal

Cancer Research

أبحاث السرطان

يوضح هذا الفيديو تحريض مرض الكسب غير المشروع المعوي مقابل المضيف ، GvHD ، في فأر متلقي مميت للإشعاع باستخدام الخلايا الجذعية المكونة للدم الخيفي والخلايا الليمفاوية التائية الحساسة للطحال المحفزة ل GvHD. يساعد هذا البروتوكول في إنشاء نموذج GvHD معوي حاد وخيمة لفهم آلية المرض وتطوير خيارات علاجية مبتكرة.

تحريض مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف في نماذج الفئران عن طريق زرع نخاع العظم الخيفي وخلايا الطحال

نقدم بروتوكولا سريعا ومرنا لنظام التعبير القهقري القائم على مستقبلات الخلايا التائية المفردة (TCR) في الجسم الحي.  تستخدم نواقل الفيروسات القهقرية لنقل الخلايا السلفية لنخاع العظم لدراسة تطور الخلايا التائية ووظيفة TCR واحد في الجسم الحي كبديل للفئران المعدلة وراثيا TCR.

فيروسات تنبيغ من خلايا نخاع العظم السلف لتوليد خلايا T مستقبلات Retrogenic الفئران

هنا نستخدم طرحه، والأشعة السينية، وانبعاث بوزيترون التصوير المقطعي/حسبت التصوير التصوير المقطعي لدراسة كيفية المثبطة mTOR النشاط آثار أورام نخاع العظم انجرافتيد المايلوما في نموذج إكسينوجرافت. وهذا يسمح للتحليلات ذات الصلة فسيولوجيا وغير الغازية، والنقل المتعدد الوسائط من تأثير العلاجات استهداف الورم النخاعي انجرافتيد نخاع العظام الأورام في فيفوالمضادة الورم النخاعي.

التصوير التصوير المقطعي المتعدد الوسائط طرحه والانبعاثات Positronic التصوير المقطعي/الحسابية للورم النخاعي المتعدد تكثيفها نخاع العظام في الفئران وتد

يصف لنا استخدام زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم (هسكت) لتقييم إمكانات خبيثة من الخلايا المكونة للدم وراثيا. هسكت مفيد لتقييم الخلايا المكونة للدم الخبيثة المختلفة في فيفو ، فضلا عن توليد مجموعة كبيرة من الفئران مع المتلازمات ميلوديسبلاستيك (حركة الديمقراطيين الاشتراكيين) أو سرطان الدم تقييم العلاجات رواية.

استخدام زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم لتقييم أصل متلازمة ميلوديسبلاستيك

مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف هو أحد المضاعفات الرئيسية بعد زرع نخاع العظم اللوجيني. تلعب الخلايا التطبيبية دورًا حاسمًا في الإمراض لمرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف. المادة الحالية يصف جديدة زرع نخاع العظم منصة للتحقيق في دور الخلايا التشجرات في تطوير مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف وتأثير الكسب غير المشروع مقابل سرطان الدم.

منصة زرع نخاع العظم للتحقيق في دور الخلايا التطبيب في مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف

نحن نصف عملية زرع البطانة اللبنية للخلايا السلفية العصبية البشرية التي تم نقلها باستخدام ناقل مراسل مزدوج يعبر عن بروتين الفلورسنت الأخضر luciferase (GFP) في دماغ الفأر. بعد الزرع ، يتم قياس إشارة luciferase بشكل متكرر باستخدام التلألؤ الحيوي في الجسم الحي والخلايا المطعمة المعبرة عن GFP المحددة في أقسام الدماغ باستخدام المجهر الفلوري.

زرع داخل المخ وتتبع التلألؤ الحيوي في الجسم الحي للخلايا السلفية العصبية البشرية في دماغ الفأر

يصف هذا البروتوكول عزل الخلايا الصعترية السلبية المزدوجة من الغدة الصعترية للفأر متبوعة بنقل الفيروسات القهقرية والمزرعة المشتركة على نظام الاستزراع المشترك لخط لحمية نخاع العظم الشبيه بدلتا (OP9-DL4) لمزيد من التحليل الوظيفي.

الزراعة المشتركة ونقل الخلايا الصعترية للفئران على الخلايا اللحمية الشبيهة بدلتا 4 لدراسة الجينات المسرطنة في سرطان الدم في الخلايا التائية

هنا ، يتم استخدام الحقن داخل الصفاق لخلايا سرطان الدم لإنشاء ونشر سرطان الدم النخاعي الحاد (AML) في الفئران. هذه الطريقة الجديدة فعالة في الزرع التسلسلي لخلايا AML ويمكن أن تكون بمثابة بديل لأولئك الذين قد يواجهون صعوبات وتناقضات مع الحقن في الوريد في الفئران.

زرع داخل الصفاق لتوليد سرطان الدم النخاعي الحاد في الفئران

يصف البروتوكول الحالي تطوير نموذج فئران قابل للتكرار للورم الدبقي في الحبل الشوكي عن طريق حقن الخلايا السرطانية في الفضاء الفقري ، مما يوفر نهجا أكثر فعالية وأقل توغلا للبحث والتطوير العلاجي.

الزرع الجراحي للخلايا السرطانية في الحبل الشوكي للفئران

يهدف البروتوكول إلى وصف نموذج الفأر لتوليد انتكاسات سرطان الدم الليمفاوي الحاد ، بناء على ديناميكيات الاستجابة للعلاج الكيميائي التحريضي.

نموذج الفئران لانتكاس ابيضاض الدم إلى العلاج الكيميائي التعريفي لسرطان الدم الليمفاوي الحاد

تعلم طريقة التنبيغ-الزرع لإنشاء نماذج فئران تعبّر عن جينات محددة في الخلايا الدموية. تُستخدم هذه التقنية لدراسة الأورام الدموية وفحص دور الجينات في تكوّن الدم الطبيعي.

تنبيغ-زرع نموذج الفأر من مرض تكاثر نقوي

استكشف المزيد من الفيديوهات