حمل كاملة ورم التجديد من مجافي الفم المنفخة من البحر شقائق النعمان النجيم Nematostella vectensis

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح السلسلة التي يمكن التنبؤ بها من التغيرات المورفولوجية التي حدثت أثناء تجديد ورم كامل من جزء صغير من الأنسجة تمت إزالته من الطرف الفموي للنبات الخيطية يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في بيولوجيا التجديد ، مثل كيفية إعادة تنظيم الخلايا الموجودة في موقع الجرح ونشرها لإعادة تشكيل الهياكل المفقودة. خطرت لي فكرة هذه الطريقة لأول مرة لأنني أردت أن أرى كيف يمكن للورم المعقد نسبيا أن يعيد نفسه معا بدءا من أقل قدر من المعلومات المورفولوجية. يعد العرض البصري لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن تقدم المرحلة بعد الجرح الأولي يتم حجب أحيانا بواسطة غشاء مخاطي.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة للحصول على فصل كامل للأنسجة في موقع الجرح ، بسبب الطبيعة اللينة واللزجة والجيلاتينية للورم الورمي. ابدأ هذا الإجراء بتكييف داء النيماتوستيلا الvectensis كما هو موضح في بروتوكول النص. من المهم بشكل خاص عند استخدام هذه التقنية أن تكون المختارة بنفس الحجم ، ولها نفس تاريخ الثقافة ، مثل التغذية المتطابقة ومعلمات الحالة الأخرى.

قم بإزالة طبق المختارة من الحاضنة إلى ضوء الغرفة قبل ساعة واحدة على الأقل من البتر. استخدم ماصة بلاستيكية عريضة التجويف لنقل الخمسة من البركة المراد بترها إلى قاع طبق تقطيع زجاجي معقم بقطر 100 ملم يحتوي على مياه البحر الاصطناعية عند ملوحة 12 جزءا في الألف. ضع الطبق على مسرح مجهر ستيريو بتكبير متغير بين 10 إلى 40 ضعفا.

حدد الاورام الحميدة المتطابقة مع الحجم من نفس الطول تقريبا وضعها في وعاء منفصل عن المستعمرة لمدة ثلاثة أيام قبل البتر. باستخدام مشرط معقم ، قم ببتر الفيزا الفموية من كل ورم للحصول على جزء من الفيزا بطول عرضه ولا يحتوي على المساريق. لتحقيق ذلك ، ضع شفرة المشرط على اتصال مع في الموقع المطلوب للبتر.

افعل ذلك إما دون مساعدة أو عن طريق الإمساك بجسم برفق باستخدام ملقط رقم خمسة. اقطع الأنسجة عن طريق الاستفادة من الشفرة المنحنية للمشرط بحركة هزازة عبر الجسم. قم بإزالة كل ورم متبرع مبتور من الطبق وأعده إلى وعاء منفصل يسمى مبتوري الأطراف.

بعد مواعدة الوعاء ، أعده إلى ثقافة المخزون. اشطف الفيزا المستقطوع المتبقية في طبق القطع في مياه البحر الاصطناعية عند ملوحة 12 جزءا لكل 1,000. بعد ذلك ، انقل كل فيزا إلى بئر معقم منفصل في صفيحة زراعة خلايا متعددة الآبار تحتوي على 10 مل من مياه البحر الاصطناعية بملوحة 12 جزءا لكل 1000 في كل بئر.

كرر هذه الخطوات لجمع ما لا يقل عن خمسة فيزا في كل بئر ليتم حجزها لكل علاج تجريبي. ضع اللوحة التي تحتوي على الفيزا في حاضنة منظمة لدرجة الحرارة عند درجة حرارة ثابتة يحددها معدل التجديد المطلوب. سجل الفيزا باستخدام مجهر مركب استريو مع تكبير متغير.

قم بتسجيل فيزا النيماتوستيلا المقطوعة حديثا كمرحلة صفر ، واستمر في التسجيل في نفس الوقت كل يوم بعد البتر ، أو DPA ، باستخدام NRSS. قم بتسجيل الفيزا كمرحلة صفر إذا ظهرت الفيزا المقطوعة حديثا ككتلة على شكل كوب تشبه البالون الرقيق مع موقع جرح مفتوح من المحتمل أن يكون مرئيا. سجل فيزا كمرحلة واحدة إذا بدا جرح البتر مغلقا.

سجل فيزا كمرحلة ثانية إذا بدا سطح القطب السمعي منتفخا ، ويكشف عن ثمانية أقواس مرتفعة مرتبة في نمط متماثل شعاعيا ومفصولة بأخاديد. في المرحلة الثانية ، لاحظ فقاعات نصف كروية صغيرة في قمة الأقواس التي يبلغ ارتفاعها حوالي العرض ، ومن المحتمل أن تكون عابرة ، وتتكون في البداية من طبقة خلية أديم ظاهر واحدة. مع تقدم العمر في العمر ، قد يصبح مغلفا بالمخاط ، والذي يجب إزالته بعناية باستخدام الملقط.

سجل فيزا كمرحلة ثالثة إذا تشكلت براعم المجسات التي تحتوي على طبقات أنسجة الأديم الباطن والأديم الظاهر بثبات في الطرف السمعي لبعض الأقواس الشعاعية على الأقل. قم بتسجيل فيزا كمرحلة رابعة إذا كان الفيزا يحتوي على ثمانية مساريقات مرئية مميزة تمتد في coelenteron من الإدخالات في جدار الجسم بأطوال السمعية الفموية التي تزيد عن ضعف عرضها الشعاعي المقاس من حيث يبدو أنها تتصل بالبلعوم في نهايته الفموية ، أو الأمعاء. أخيرا ، قم بتسجيل فيزا كمرحلة خامسة إذا كان الفيزا يحتوي على أكثر من أربعة مسارينتر مع طيات ، وكان الطيات أكثر امتلاء ومتعرجة مما كانت عليه في المرحلة الرابعة.

في المرحلة الخامسة ، يكون للحيوان مظهر بالغ طبيعي تقريبا ، ولكن لا توجد خلايا غدد تناسلية مرئية. هذه المجموعة من فيزا النيماتوستيلا الضابطة المعالجة ب 0.1 في المائة DMSO قد تجددت تماما إلى المرحلة الخامسة. ومع ذلك ، فشلت فيزا المعالجة بالكلوروكين في تكوين المساريقات المكتملة بالكامل.

تظهر لقطة مقربة وجود وعدم وجود الطيات في المساريقيين في الفيزا التي تم تحضنها في الكلوروكين. يوضح هذا الرسم البياني النتائج الإجمالية للمعالجة بالكلوروكين. تسبب أي علاج بين 10 و 50 ميكرومولار في حدوث عيوب مماثلة ، معظمها عدم وجود إصلاح كامل للمسارنتر حيث تفتقر المساريق إلى الطيات.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في أقل من ساعة لكل صفيحة مكونة من ستة آبار تحتوي على 30 قطعة فيزا. التسجيل سريع ، وربما يتطلب نصف ساعة لكل لوحة مكررة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية بتر الفيزا لتصور التغيرات المورفولوجية التي تحدث أثناء تجديد ورم كامل من جزء صغير من الأنسجة الفموية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر مراحل مورفولوجية يتم فيها تثبيت الأحداث الجزيئية الكامنة وراء تجديد ورم كامل من كوب من الأنسجة الموحدة بصريا. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تضع للحيوانات مسبقا فيما يتعلق بالتاريخ الغذائي ، والتقسيم لاستبعاد المساريق البالغ ، وتوحيد حجم الفيزا المتجددة لتقليل التباين داخل العلاجات. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تقييم آثار الطفرات الجينية أو اضطرابات مسار الإشارات مع الجزيئات الصغيرة ، على سبيل المثال.

أو يمكن أن ترتبط التغيرات المورفولوجية بالتحليل المجهري للانتشار الذاتي أو تتبع النسب أو التعبير الجيني في الموقع الثاني. ستمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا التجديد لاستكشاف بيولوجيا الخلية ومسارات الإشارات والعمليات المورفوجينية التي تكمن وراء القدرة التجديدية الرائعة لهذا الكائن الحي النموذجي.