قياس صلابة من فيفو السابقين ماوس Aortas باستخدام مجهر القوة الذرية

الهدف العام من هذا البروتوكول هو وصف إجراءات استخدام الفحص المجهري للقوة الذرية لقياس معامل المرونة Ex Vivo لشريان أورطي الفأر. تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الميكانيكا الحيوية للأوعية الدموية والأمراض مثل أمراض القلب والأوعية الدموية والشيخوخة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي الخصائص الميكانيكية الحيوية المميزة ل AFM للعينات البيولوجية اللينة مثل الشرايين والخلايا بدرجة كبيرة من الدقة على مستويات Danoscale.

سأقدم إجراءات AFM ، وسيوضح الدكتور شو لين ليو ، الباحث المشارك من مختبرنا ، كيفية عزل الشريان الأورطي للفأر. للبدء ، قم بالقتل الرحيم للفأر وتشريحه إلى الشريان الأورطي كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. باستخدام زوج من الملقط الصغير ، أمسك الدهون المحيطة بالشريان الأورطي واستخدم مقصا صغيرا لقطع الدهون الموجودة حول الشريان الأورطي بعناية.

بعد ذلك ، أمسك الشريان الأورطي برفق بالملقط وقم بقطع الوعاء في بداية الشريان الأورطي الصاعد وآخر في نهاية الشريان الأورطي الهابط ، فوق الشريان الأورطي البطني مباشرة. انقل الشريان الأورطي المقطوع إلى طبق 60 ملم يحتوي على PBS بدون كالسيوم أو مغنيسيوم. في الطبق ، استمر في تشريح أي أنسجة دهنية متبقية من الشريان الأورطي ثم افتح الشريان الأورطي طوليا.

بعد ذلك ، قم بقص قطعة 2 ملم × 4 ملم من الشريان الأورطي الهابط ، وقطعة بنفس الحجم من قوس الأبهر ، لتحليلها باستخدام مجهر القوة الذرية. ضع هذه القطع من المناديل في طبق بلاستيكي طازج بحجم 60 ملم ، واحتفظ بها رطبة في قطرة من PBS. قم بإزالة PBS بعناية من حول الأنسجة باستخدام منديل مختبري دون لمس الشريان الأورطي.

تأكد من أن الجانب اللمعي من الأنسجة متجها لأعلى ، واستخدم خمسة إلى 10 ميكرولترات من مادة لاصقة cyanoacrylate للصق كل طرف من طرفي الشريان الأورطي المفتوح برفق على اللوحة. من الأهمية بمكان ألا يتم تمدد الشريان الأورطي أثناء هذه العملية. عند الانتهاء ، تأكد من أن الشريان الأورطي الملصق غير مطوي أو عائم.

بعد تجفيف الغراء بالهواء على الشريان الأورطي لمدة 30 إلى 60 ثانية ، أضف PBS برفق واغمر العينة. باستخدام الملقط ، حرك مسبار نترات السيليكون AFM برأس كروي على حامل المسبار. بعد ذلك، قم بتأمين حامل المسبار بإحكام على حامل ZScanner لرأس AFM.

بعد ذلك ، افتح برنامج AFM. اختر نوع التجربة بالانتقال إلى فئة التجربة وتحديد وضع جهة الاتصال. بعد ذلك، انتقل إلى مجموعة التجارب وحدد وضع جهة الاتصال في Fluid، وأخيرا انتقل إلى التجربة وحدد وضع الاتصال في Fluid.

بمجرد تحديدها ، انقر فوق تحميل التجربة. سيؤدي هذا إلى تشغيل الليزر. بعد ذلك ، قم بإعداد عينة تستخدم لمحاذاة الليزر كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب.

ضع العينة على AFM. ضع بقعة الليزر على طرف مسبار AFM ، عن طريق ضبط مقابض تحديد المواقع بالليزر. بعد ذلك ، استخدم مقابض تحديد موضع الكاشف لضبط موضع الصمام الثنائي للصور حتى تكون قيم الانحراف الرأسي بين صفر وسالب فولت واحد ، ويكون الانحراف الأفقي قريبا من صفر فولت.

بعد ذلك ، تحقق من تعظيم إشارة مجموع الليزر. إذا لزم الأمر ، أعد ضبط موضع شعاع الليزر على طرف AFM ، وموضع الصمام الثنائي للصور ، للحصول على أقصى إشارة مجموع. لبدء المعايرة، حدد معلمات التحقق وقم بتعيين معلمة حجم المسح الضوئي إلى الصفر.

اضبط معدل المسح الضوئي على هرتز واحد. اضبط العينة/الخط على 256، ونقطة ضبط الانحراف على 20 نانومتر. ثم حدد مشاركة.

بمجرد أن يتلامس المسبار مع سطح اللوحة ، انقر فوق Ramp. بعد ذلك ، حدد الوضع الموسع في قائمة شريط أدوات المسح الضوئي ، وقم بتعيين المعلمات كما هو موضح هنا. في شريط أدوات المنحدر، حدد استمرارية المنحدر، واحصل على منحنى قوة على اللوحة.

في منحنى القوة هذا ، اضبط القناة 1 على خطأ الانحراف للسماح للبرنامج برسم النتائج كانحراف رأسي مقابل موضع Z. انقر على الأطراف اليسرى أو اليمنى عند منحنى القوة واسحب المؤشر ليشمل منطقة خطية من منحنى القوة التي ستكون مناسبة للخط المستقيم. ثم حدد Ramp في شريط الأدوات وانقر فوق Update Sensitivity.

سجل القيمة الحالية. بعد ذلك ، حدد معايرة ، وانقر فوق كاشف. الإدخال ومتوسط القيمة من القياسات الخمسة في مربع حساسية الانحراف.

انقر فوق سحب مرتين إلى ثلاث مرات ، لرفع رأس AFM ومنع التفاعل بين طرف AFM واللوحة أثناء عملية الضبط الحراري. ثم انقر فوق Thermal Tune في شريط الأدوات. اضبط نطاق الضبط الحراري على ما بين واحد و 100 كيلو هرتز ، واضبط تصحيح حساسية الانحراف على 1.144 للناتئ على شكل حرف V ، و 1.166 للناتئ المستطيل.

في قائمة الضبط الحراري ، انقر فوق الحصول على البيانات للحصول على منحنى ضبط حراري. بعد ذلك ، ضع الشرطة الحمراء على الخطوط على جانبي المنحنى ، وحدد إما Lorentzian أو نموذج المذبذب التوافقي البسيط اعتمادا على أيهما يناسب البيانات بشكل أفضل. ثم انقر فوق Fit Data وحدد Calculate Spring K لحفظ هذه القيمة.

ضع طبق ثقافة 60 ملم يحتوي على الأنسجة الأبهرية على مرحلة المجهر ، وقم بتأمين اللوحة بحامل اللوحة المغناطيسية. بمجرد تعشيق الشريان الأورطي مع الكابولي ، تأكد من استقرار مركز بيزو ، وانقر على المنحدر. اضبط حجم المنحدر على ثلاثة ميكرومترات، ووضع الزناد إلى نسبي، وعتبة الزناد على 100 نانومتر.

ثم حدد منحدر مستمر. لاحظ أن نقطة التلامس بين المسبار والعينة تحدث عند المركز تقريبا إلى الأرباع الثلاثة السفلية من دورة منحدر Z. إذا لم يتم ملاحظة ذلك ، فقم بفك الارتباط بالعينة ، واضبط حجم المنحدر حسب الحاجة ، وأعد تعشيق العينة.

بعد ذلك ، انقر فوق المجهر في شريط القائمة ، وحدد إعدادات المشاركة. قم بتغيير سحب SPM إلى 30 ميكرومتر، ثم انقر فوق موافق. بعد مراقبة منحنى القوة ، انقر فوق Capture في شريط القائمة وحدد Capture Filename. أدخل اسم الملف المطلوب الذي ينتهي ب OOO ، وحدد مجلدا معينا ، واحفظ البيانات.

لبدء التحليل ، افتح برنامج تحليل منحنى القوة ، وقم بتحميل الملف المراد تحليله ، وقم بتعديل البيانات وتنعيمها كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. بعد ذلك ، حدد تصحيح خط الأساس في شريط القائمة ، وقم بتعيين المدخلات كما هو موضح هنا. بعد ذلك ، اضبط الخط الأزرق الرأسي المنقط على الرسم البياني ليشمل الجزء المسطح من منحنى القوة وانقر فوق تنفيذ.

بعد ذلك ، انقر فوق المسافة البادئة في قائمة شريط الأدوات ، وقم بتعيين المدخلات كما هو موضح هنا. احفظ هذه القيم ، وحلل معامل يونغ لكل مجال من مجالات الاهتمام عن طريق قياس خمسة منحنيات قوة لكل منطقة يتم أخذها على مسافة صغيرة من بعضها البعض. لتحديد الصلابة الكلية لعينة الأنسجة ، يجب إجراء ما يصل إلى 25 قياسا على خمس مناطق مختلفة من منطقة العينة داخل الأنسجة.

يمكن استخدام هذه المناطق لمقارنة الأنسجة في مواقع مختلفة، مثل قوس الأبهر والشريان الأورطي الهابط. في هذه الرسوم البيانية ، تظهر منحنيات القوة التمثيلية للشريان الأورطي الهابط والقوس الأبهري من نفس عينة الشريان الأورطي الفأري. بناء على هذه البيانات ، يمكن حساب معامل المرونة لكل مجموعة ، واستخدامه للمقارنة بين المناطق أو الظروف المختلفة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، سيكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الشريان الأورطي للفأر بشكل صحيح وقياس معامل المرونة بواسطة الفحص المجهري للقوة الذرية. بعد محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إجراء قياس AFM مباشرة بعد عزل الأنسجة. بمجرد إتقان الشريان الأورطي ، يمكن إكمال عزل الشريان الأورطي في حوالي 45 دقيقة لكل فأر ، ويمكن إكمال قياس وتحليل AFM في ساعة ونصف ، إذا تم إجراؤه بشكل صحيح.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل فحوصات التآكل المناعي أو التكاثر من أجل الإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بإعادة تشكيل الأوعية الدموية أو تكاثر خلايا العضلات الملساء الوعائية.